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Nanopore宏基因组测序6小时内精准识别下呼吸道病

下呼吸道感染是全球传染病死亡的主要原因,导致全球每年300万人死亡。引发感染的病原菌类型广泛。目前检测的金标准是细菌培养法,此方法周期长,敏感性较差。患者在此期间通常接受广谱性抗生素治疗,加剧了抗生素抗药性的问题。如何快速诊断下呼吸道感染并实现定制治疗呢?
2019年7月《Nature Biotechnology》的封面文章:《Nanopore宏基因组测序6小时内精准识别下呼吸道病原体》一文,开发了一种基于Nanopore测序的临床宏基因组学方法,可从临床呼吸道样本中去除高达99.99%的宿主DNA,并能在6小时内快速识别病原体和抗生素抗性基因。

发表期刊:Nature biotechnology
发表时间:2019年7月
影响因子:31.864

材料和方法

材料:
81个已用常规培养法诊断过的样品(包括唾液,气管内分泌物和气管内吸出物),其中40个样品进行方法测试,另外41个样品对测试方法进行优化。
测序策略:
使用Nanopore MinION测序,混测6张芯片。
 
研究思路
 

 
研究结果

1. 宏基因组测方法的检测结果

对40个样品宿主DNA进行去除后进行宏基因组测序,该方法的灵敏度为91.4%,特异性为100%,时间为8h。经过qPCR验证,皂苷可以消除大约99.9%的宿主DNA。

图1 宏基因组测试方法和优化方法的流程示意图
 
发现了5个未被培养法检测到的病原体:在P8中发现了卡他莫拉菌;P14中的大肠杆菌;P22和P30中的流感嗜血杆菌;P29中肺炎克雷伯菌和卡他莫拉菌。
 
表1 测试宏基因组方法和常规培养方法的结果比较

1. 宏基因组测序方法的优化
球磨的方法可以使金黄色葡萄球菌DNA含量增加21倍,因此在优化的方法中加入了球磨的步骤。
通过减少DNA酶处理步骤和清洗次数,将去除宿主DNA步骤从90分钟缩短至50分钟。将文库制备过程中PCR扩增时间从6min缩短到4min。上述优化方法,将整个测序前的处理时间缩短至4h以内。
 
2. 优化方法的检测结果
用41份疑似感染呼吸道病原体的样品进行宏基因组测序方法的优化,发现经过皂苷处理,可以去除高达99.99%的人类DNA。
优化后的方法对下呼吸道感染病原菌检测的灵敏度为96.6%,特异性为41.7%。从样品到结果整个过程时间为6小时。
发现了8个样品中常规培养方法遗漏的病原体。7个常规培养方法检测为正常样品,而优化的方法可以检测多达2种以上的病原体。

 
表2 在去除人DNA和未去除人DNA条件下的革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌感染的痰液标本的人和细菌DNA qPCR定量结果

结合qPCR和特异性基因分析,确认优化后的宏基因组测序方法敏感性为100%,特异性为100%。
 
1. 抗生素抗性基因检测
细菌培养的方法从33个样品中,只能发现43个抗性基因,而宏基因组测序优化的方法从41个样品中检测出183个抗性基因。
其中有26个是培养样品中固有的,剩余157个中有24个与表型相匹配,14个无法确认相关的耐药性,16个基因与培养的分离株表型不匹配,但是对相关抗生素敏感,42个基因不太可能来自实验室培养的物种,56个基因可能来源于正常菌群。

 
表3 优化方法检测的抗性基因列表

1. 有参基因组组装
分别对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和大肠杆菌(E. Coli)序列进行有参基因组组装,在测序2h,经过宿主DNA消除处理, MRSA可以组装出28条contigs;E. Coli可以组装出83个contigs。对比结果如下表:



图2 MRSAE. Coli基因组组装结果


1. 时间点分析
在测序5min,经过宿主DNA消除的样品,MRSA有1.6X的覆盖率,可以检测2个mecA基因。而未经过宿主DNA消除的样品,MRSA只有0.2X的覆盖率,且未发现 mecA 基因。

图2 MRSAE. Coli基因组在不同条件下的覆盖率
 

在测序20min,经过宿主DNA消除的样品,E. Coli有5.7X的覆盖率,可以检测到3种抗性基因(blaTEM、dfrA17和sul1)。而未消除的样品,只有0.06X的覆盖率。
测序2h,经过宿主DNA消除的样品,可以检测到47个blaTEM、37个sulf1和21个dfrA17。而未经过宿主DNA消除的样品只能检测到sul1,未发现blaTEM和dfrA17基因。
图2 MRSAE. Coli在不同条件下的抗生素基因检测结果

 

总结
细菌性下呼吸道感染危害大,传统的细菌培养法诊断敏感性差且太慢,不能指导早期的靶向抗生素治疗。本研究开发了一种用于细菌性下呼吸道感染诊断的Nanopore宏基因组测序方法,使用皂苷有效去除99.99%的宿主DNA。通过优化实验步骤,将检测时间缩短至6小时。对病原体检测的敏感性为96.6%、特异性为41.7%,并能准确检测抗生素抗性基因。结合qPCR和特异性基因分析,特异性和灵敏度可达100%。因此Nanopore宏基因组可以快速准确地诊断细菌性下呼吸道感染,将有助于减少广谱抗生素的使用。
 
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