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Nanopore宏基因组测序直接从临床呼吸道样品检测流

英国科学家在2020年1月发表的最新文献中使用Nanopore宏基因组测序从40份流感病人鼻咽拭子样品中检测到1份样品中含有冠状病毒。这一份样品属于流感和冠状病毒的复合感染。
张文宏医生说:“流感年年有,我们只是不知道下一次全球大爆发的时间,一定会来的。”为什么说一定会来的?如何更有效的检测流感病毒是医学和科研工作者面临的一大挑战。病毒宏基因组测序技术为流感病毒的诊断提供了可能性,该技术不仅可以分析病毒的传播、进化和耐药性,还可以检测到其他病毒,如冠状病毒。下方文章详细介绍了应用Nanopore进行病毒宏基因组研究的方法。


研究背景

流感病毒是一种含有8段主要序列基因组大小为16Kb的RNA病毒,具有高致病性、变异能力强、人畜共患病和流行潜力大的特点。季节性流感每年在全球范围内造成65万人死亡,仅H3N2变异就导致美国每年35,000人死亡。老年人、婴儿、幼儿、孕妇、潜在肺病患者和免疫功能低下者为易感人群。
目前流感病毒的临床诊断实验主要是呼吸道样本抗原的免疫检测(POCT)和核酸的PCR检测。前者灵敏度低但速度快,后者灵敏度高但是耗时;并且大多诊断机构给的都是定性结果。因此快速、灵敏度高可以定量或者半定量的检测技术的开发显得十分重要。
Nanopore测序技术是一种便携式实时长读长单分子测序技术,并且在一系列病毒检测中获得成功。该研究旨在使用基于Nanopore的宏基因组测序检测流感病毒。



发表杂志:Journal of Clinical Microbiology
发表日期:2020.01
影响因子:4.959

宏基因组测序实验流程的优化




对个体临床样品进行Nanopore宏基因组测序的流程



材料和方法

样品来自于英国东南部的牛津大学医院的临床微生物学实验室剩余样品。是使用CDC网站上描述的标准方法采集的鼻咽拭子样品。在临床实验室使用基于PCR技术的GeneXpert对流感病毒A和B以及RSV进行检测。
为了进行方法评估,将样品分成四类,阳性池、阴性池、阳性个体和阴性个体。将19个临床诊断实验室检测出流感病毒A阳性的咽拭子样本混合成阳性池,以提供足够大的样本来评估重复性;分别混合24、38和38个流感病毒阴性的咽拭子样本构成3个阴性池(图1);阳性个体40个(35个喉拭子和5个鼻拭子)样品,都是流感病毒A或B阳性的个体;阴性个体10个,都是流感病毒阴性的咽拭子样品。
使用qRT-PCR方法检测阳性池中流感病毒A和Hazara病毒的滴度。
将每个阴性池等分成5份,分别加入0,102,103,104和106的流感病毒A;同时每个样品加入每毫升104个拷贝的在临床样品中不会出现的外援Hazara病毒,作为内部阳性对照(图1)。
 

图1 Nanopore宏基因组测序的实验步骤(A)和样品混池的方法(B)


在建立详细描述的方案之前,评估了两个可能优化的实验步骤,第一是病毒纯化的方法,离心法与过滤法;第二是优化cDNA合成时间的方法。
最后将该测序方法用于白鼬感染H1N1pdm09鼻腔洗液的样品,分别选取3个独立的白鼬个体,感染H1N1pdm09前3天和感染后第1天,第3天和第5天的样品。


研究结果

1.提高拭子病毒reads比例优化方法

常规宏基因组方法:分别对5个阳性样品和5个阴性样品(均添加了104 genome copies/ml Hazara病毒作为内部阳性对照),使用常规方法对核酸进行提取,采用不依赖序列的单引物扩增(SISPA)后进行Nanopore测序,获取的数据大多是细菌的序列,病毒的序列较少(图S1)。


图S1 常规方法和过滤方法检测到的病毒reads数的比较
 
 
优化方法:

(1)在核酸提取之前,将10个样品分别通过0.4μm的过滤器,病毒reads可以增加几个数量级(图S1)。
(2)样品进行快速离心(16,000 g for 2 min),取上清液进行提取,可以去除大部分细菌和人体细胞。过滤和离心,对流感病毒和Hazara病毒的富集效果相似(图S2)。由于离心方法更简单,成本更低,所以选择离心进行后续实验。
 



图S2 过滤和离心检测的流感病毒A和Hazara病毒reads数的比较
 

2.缩短cDNA合成时间优化方法

常规宏基因组方法:用随机标记引物逆转录成cDNA,随后进行SISPA扩增,需要的时间分别为1小时和3小时45分钟。
优化方法:将逆转录酶从SuperScript III升级到SuperScript IV,将孵育时间缩短到10分钟(比常规处理时间减少50分钟),并将PCR扩展时间从5分钟缩短到2分钟(比常规处理时间减少1小时30分钟)。优化的方法检测病毒效果相同(图S3),但可以减少2小时20分钟,最终选择优化的方法进行后续实验,整个实验过程需要的时间约8小时。


图S3 常规方法和缩短处理时间方法检测的流感病毒A和Hazara病毒reads数的比较


3.Nanopore测序对Hazara病毒的检测


经过SISPA扩增后,检测cDNA总浓度,结果显示,1和2号池含有数量相当的背景材料,3号池包含更多的背景材料(图2A)。测序结果显示,1号和2号池中检测到的Hazara病毒reads比率一致,而在3号池中检测到的Hazara病毒reads比率较低,进一步证实更多的非病毒RNA被引入(图2B)。

图2  3种混池中不同滴度样品检测的cDNA和病毒reads数结果

 
4.Nanopore测序对混合样品流感病毒的检测


比对到流感病毒A基因组的reads比率,随稀释浓度的降低而下降。在流感病毒滴度<103 copies /ml时,检测到的流感病毒reads比率不同(图2B),表明检测限为102-103 influenza virus copies/ml。
 

5.从混合样品检测流感病毒基因组


流感病毒A滴度为10copies/ml时,基因组每个片段的覆盖率均大于99.3%(图3A),滴度为104 copies/ml,1号和2号池,每个片段覆盖率为90.3%。滴度<104 copies/ml,每个片段的覆盖度变化较大,但滴度为103 copies/ml时,仍然2/3的混合样品可以检测到H3N2(表1)。


图3 Nanopore测序检测混合样本中流感病毒和Hazara病毒基因组的覆盖情况

 
 
表1 Nanopore测序检测混合样本中流感病毒A和Hazara病毒基因组reads数概述


6.从个体临床样本中检测流感病毒

分别对临床诊断的40个流感病毒阳性样品和10个阴性样本进行Nanopore宏基因组测序,12个样品混合测一张芯片,每个临床样本产生的总reads为1.0*105-2.4*106(中位数,3.8*105 reads)。
CT<30(CT值指每个样品反应管内荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)时,27个样本可以检测到流感病毒A/B,检测的流感病毒reads数范围为6-274,955。在CT>30时,6/13的样本检测到流感病毒(reads数范围为6-92,057)(图4)。CT值为36.8时,检测到部分流感病毒。10个阴性样本没有检测到流感病毒。基于上述结果,敏感性为83%,特异性为100%。

图4 在一定CT值范围内,个体样品Nanopore测序获得的流感病毒总数和比例

 

7.Nanopore和Illumina测序的比较

从病毒效价范围内选择了15个样本,使用Illumina Miseq平台重新测序。结果显示,两种测序技术检测到的流感病毒reads比例相似,大部分一致性序列的一致性为100%,除了一个样本有7个核苷酸差异(一致性为99.94%)。
 


8.流感病毒系统进化树

使用HA基因的一致性序列构建系统进化树(图5),结果与流感季节发生的地理环境分布一致。

图5 Nanopore和Illumina测序获得的流感病毒HA基因的系统发育树

 

10.其他RNA病毒的检测

在50个临床样本中,检测到了其他RNA病毒,其中给一个样品中有109条reads比对到人冠状病毒,且有>1.5*104流感病毒reads,表明属于合并感染。此外,从流感病毒阴性样本中检测到>4.0*104人偏肺病毒reads(99.8%的覆盖率)。
 


11.动物模型研究

最后将该测序方法用于3个独立的感染H1N1pdm09白鼬个体样品,测试宏基因组测序在感染流感病毒A的不同时间的重现性。结果表明在每个时间点检测到的病毒reads比例与病毒滴度一致(图6)。而且在感染后第2、3和5天,使用Nanopore测序和Illumina测序产生的一致序列一致性为100%。
图6 感染流感病毒A的3只实验室白鼬在不同时间的流感病毒检测结果
 


总结

本研究首次成功地将Nanopore宏基因组测序直接应用于临床呼吸道样本检测流感病毒。该方法具有良好的特异性,敏感性因病毒滴度而异。优化的方法可以减少人类和细菌核酸,缩短了从样品到数据的时间。该方法可以进一步优化和验证,以提高流感病毒的敏感性,识别其他RNA病毒,检测耐药突变,并洞察准种多样性。同时也表明Nanopore平台有望用于流感病毒和其他呼吸道病毒的诊断和遗传分析。
 
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