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基于Nanopore测序技术的人肠道病毒组研究

研究背景

肠道病毒在维持肠道微生物组成和功能以及宿主生理和免疫方面起着重要作用。然而,由于病毒难以富集,以及目前测序读长短的原因,人类肠道病毒的研究并不多。该研究开发了一种使用Nanopore测序,结合物理富集、逆转录和随机扩增,分析人类肠道病毒的完整工作流程。

 

该研究使用ONT测序平台直接对病毒DNA测序,或病毒核酸(DNA和RNA)扩增后使用ONT测序,获得了更多病毒多样性和当前数据库没有收录的病毒序列。并通过直接DNA测序检测到表观遗传修饰的噬菌体基因组。该方法可以应用于其他病毒学研究,包括动物肠道、土壤和水体等。该研究表明,测序技术的不断进步和生物信息学的改进将为病毒的组成、多样性及其潜在的重要功能带来更多的认识。

 

研究思路



 

材料和方法
5名健康志愿者的冷冻粪便样品(约1.5 g),使用PBS稀释混匀,4 °C下4,500 rpm离心10 min,去除残渣,取上清液,再在4 °C下4,500 rpm离心10 min,通过0.45 μm PVDF膜过滤,去除真核细胞和细菌细胞大小的颗粒。然后在4 °C下,180,000 ×g下超速离心3 h,将沉淀悬浮在PBS中,在37 °C下,用DNase和RNase A处理。使用病毒核酸提取试剂盒提取,获得病毒核酸(DNA和RNA),并用无RNase水洗脱(图1)。

图1 富集病毒颗粒(VLPs)、核酸提取和ONT测序工作流程
 

将提取获得的5份样品,分别取一半进行逆转录后,随机扩增,获得DNA/cDNA。另一半原始DNA和扩增获得的DNA/cDNA样品分别建库,使用PromthION混合测一张芯片。

 

研究结果

1 病毒分离、富集和测序

通过测序,扩增组获得8.2Gb原始数据,每个样本数据量的中位数为1.7Gb;原始DNA组获得452Mb原始数据,每个样本数据量的中位数为67Mb(表S1)。

 

表S1 5个体提取的DNA/cDNA总量及测序产出

 

2 ONT测序揭示的健康个体病毒组成

将扩增组数据比对到NCBI病毒数据库。结果显示,噬菌体家族占大多数,包括Caudovirals目(siphovirdae科, podoviridae科),Inoviridae 科和 Microviridae科,与其他研究结果一致。同时,还检测到真核细胞CRESS-DNA病毒(Genomoviridae科)和植物RNA病毒(包括Virgaviridae 和Alphaflexiviridae)。表明个体特异性可能反应出粪便病毒群落的特性(图2)。而未培养的噬菌体WW-nAnB菌株3在5个个体的扩增组中均被检测到。

图2 每个个体的病毒组成和相对丰度

 

比较扩增组和原始DNA组结果,除了个体2和5之外,扩增组中病毒的多样性更高。此外,在5个个体中,2组中常见病毒表现出的变化,证明可检测到的逆转录和随机扩增方法存在的偏好性。

 

3 病毒基因组组装

使用Canu对2组数据中分离出的病毒reads进行组装,共获得1564个contigs,每个个体的原始DNA组和扩增组的contigs中位数分别为15和347。将contigs比对数据库,比对率很低,表明有大量潜在的新基因组。

 

将分离出的病毒reads比对回contigs,统计比对到最长contig的原始reads长度,并计算原始reads比对到contig的长度比例(图3)。扩增组中,每个样本中最长reads长度均大于全长contig的15%,最高可达40%。原始DNA组中,比例较高,少数reads比最终的contigs长(图3),可能是由于Canu组装舍弃了部分较低质量reads导致的结果。

图3 原始reads比对到contig的长度比例

 

4 使用ONT进行病毒表观基因组检测

ONT测序可以直接获得DNA碱基修饰信息。该研究分析了几个覆盖深度均>10X的contigs上的甲基化信息。对于唯一具有已知信息的contig (Contig00000015),在8kb基因组中共检测到17个5mC和120个6mA甲基化位点(图4)。此外,还发现了4个覆盖深度>10X的contigs,在数据库中没有比对到近缘物种。这些contigs可能是新型病毒,具有占基因组0.3-1.8%的5mC甲基化位点,和占基因组0.7-2.5%的6mA甲基化位点。

图4 鉴定的不同甲基化位点和识别的motif

 

总结

该研究使用ONT测序平台直接对病毒DNA测序,或病毒核酸(DNA和RNA)扩增后使用ONT测序,获得了更多病毒多样性和当前数据库没有收录的病毒序列。并通过直接DNA测序检测到表观遗传修饰的噬菌体基因组。该方法可以应用于其他病毒学研究,包括动物肠道、土壤和水体等。该研究表明,测序技术的不断进步和生物信息学的改进将为病毒的组成、多样性及其潜在的重要功能带来更多的认识。

 

参考文献

Jiabao C. et al. Profiling of Human Gut Virome with Oxford Nanopore Technology. BioRxiv. 2020.

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