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Direct RNA测序研究经典思路总结,高分必备

转录组测序是研究基因表达调控的主要手段。二代高通量测序(NGS)技术通量高,但测序读长短,产生的拼接错误往往造成转录本结构鉴定不完整,准确鉴定转录本结构,是深入研究基因表达调控模式的基础。

 

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图1 Direct RNA测序特色分析内容

 

近期,贝纳基因Direct RNA测序再次打破世界纪录,24张芯片同时上机。单张芯片平均产出9.17Gb,最高产出11.39Gb,平均N50 1.13kb。本次同批上机测序的24张芯片,对应样品为24个植物样品,单样品数据产出详见下图:

 

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图2 同时上机的24个样品的数据产出

 

Direct RNA测序是Nanopore平台应用于转录组研究的顶尖测序技术,也是当前最先进的集transcript结构鉴定、RNA甲基化修饰检测和Poly(A)特征解析于一身的转录组测序技术,是发表高分文章的必备利器。小编综合梳理了Direct RNA测序研究的最新成果,总结下来,主要思路有三点:

 

Direct RNA测序真实还原转录本/基因的序列结构

 

1.Direct RNA测序鉴定逆转录引起的假阳性exitrons

文章题目:Direct long-read RNA sequencing identifies a subset of questionable exitrons likely arising from reverse transcription artifacts

研究物种:人

发表刊物:Genome Biology(IF=13.58)

发表时间:2021年6月

 

研究结果:

在淋巴母细胞白血病中,对CD19导向免疫疗法的耐药性被归因于若干异常的CD19 pre-mRNA剪接事件,例如最新报道的CD19外显子2中的内含子剪切。但研究人员通过DRS技术发现,CD19外显子的这种结构是逆转录的产物。该研究表明所有依赖RT的方案,包括标准RT-PCR和短读长RNA-seq,以及基于ONT或者PB的cDNA-seq,RT产物可能会被误判为假定的exitrons(外内含子)或不存在的isoform。证明DRS除了检测RNA修饰外,还可以更精确地鉴定真实的isoform。

 

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图3 已报道的CD19-ex2part实际上是逆转录产物

 

Direct RNA测序检测RNA甲基化修饰

 

2.利用xPore对Nanopore Direct RNA测序数据进行差异RNA修饰分析

文章题目Identification of differential RNA modifications from nanopore direct RNA sequencing with xPore

研究物种:人

发表刊物:Nature Biotechnology(IF=54.908)

发表时间:2021年7月

 

研究结果:

 

RNA修饰如N6-甲基腺苷(m6A),具有调控细胞RNA的功能。然而,RNA修饰的差异分析一直具有挑战性。该研究开发了一种xPore算法,将xPore方法应用于6个细胞系以及无对照样本的多发性骨髓瘤患者样本的Direct RNA-seq数据,发现在不同细胞类型中,m6A修饰类型相同,而修饰比率表现出显著差异。本研究结果表明,Direct RNA-seq数据借助xPore算法可以高精度鉴定RNA修饰,实现从单次高通量实验中分析差异修饰和表达的转录本。

 

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图4 差异RNA修饰位点的鉴定

 

Direct RNA测序解析Poly(A)长度特征

 

3.Direct RNA测序揭示骨形成所必需的TENT5A介导的细胞质聚腺苷酸化

文章题目:Cytoplasmic poly(A)denylation by TENT5A is required for proper bone formation

研究物种:小鼠

发表刊物:Cell Reports(IF=8.109)

发表时间:2021年4月

 

研究结果:

成骨细胞通过分泌I型胶原和矿物质化羟基磷灰石晶体的基质成分来协调骨形成。在先天性骨病成骨不全患者中发现突变的TENT5A是一种细胞质多聚(a)聚合酶,在调节骨矿化中发挥重要作用。直接RNA测序结果显示,成骨细胞分化过程可诱发TENT5A产生,使得编码Col1a1、Col1a2和其他参与成骨的分泌蛋白的mRNA多聚腺苷酸化,从而增加这些mRNA的表达。在Tent5a KO(Tent5a缺陷型)新生小鼠颅骨和成年小鼠成骨细胞中发现,具有近端poly(A)信号的3’UTR 较短的TENT5A底物mRNA更依赖于Tent5A,且poly(A)尾较长。

 

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图5 TENT5A底物的Poly(A)长度、3’UTR与表达量关联

 

参考文献:

1. Schulz, L. et al. Direct long-read RNA sequencing identifies a subset of questionable exitrons likely arising from reverse transcription artifacts. Genome Biology,2021.

2. Pratanwanich Ploy N, Yao Fei, Chen Ying et al. Identification of differential RNA modifications from nanopore direct RNA sequencing with xPore. Nat Biotechnol, 2021.

3. Olga G, et al. Cytoplasmic Poly(A)denylation by TENT5A is required for proper bone formation. Cell Reports. 2021.

 

 

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