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Nature communication|波兰科学院基于纳米孔直接RNA技术对酿酒酵母中RNA polyA尾代谢进行全局解析

RNA-3'端多聚腺苷酸化(poly[A]-tail) 是一种广泛存在的修饰,与许多生物学功能相关。在出芽酿酒酵母中,多聚腺苷酸化决定了转录产物最终命运,大部分酵母 poly(A) 尾长最多有70个腺苷 (A) 。RNA二代测序(RNA-seq)实验仅检测到多聚腺苷酸化末端或内部衰变的中间体,然而由于测序方法的检测限制,并不具有代表性。酿酒酵母poly(A) 聚合酶、外泌体及其辅因子和去腺苷酸酶复合物以及对形成所有 RNA 生物类型的 poly(A) 尾长以及丰度等作用模型尚不明确。虽然有学者提出一些研究模型,但在酵母细胞中缺乏全面的体内转录组学证据。

 

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2021年8月,波兰科学院生化与生物物理研究所团队使用纳米孔直接RNA测序技术(DRS, Direct RNA sequencing technology)研究poly(A)+ RNA分级,并通过基于poly(A)测试的方法或尾部测序法(PAT, poly[A] test or TAIL-seq)相比较,提高聚腺苷长reads识别,进而定义酿酒酵母poly(A) 聚合酶、外泌体及其辅因子和去腺苷酸酶复合物对形成各种RNA 生物类型的 poly(A) 尾长和丰度的作用机制,并阐述RNA 3'端多聚腺苷酸化(poly[A]-tail) 在酵母细胞体内的剪辑或延伸过程。研究成果发表在Nature communications(IF= 14.919),文章题目为:Global view on the metabolism of RNA poly(A) tails in yeast Saccharomyces cerevisiae。文末可见本公众号解读的其他直接RNA文章。

 

摘要

 

多聚腺苷尾 (poly[A]-tail) 是真核信使 RNA (mRNA) 和非编码 RNA (ncRNA) 的通用修饰。在出芽酿酒酵母中Pap1 合成的 mRNA Poly(A) 尾增强了mRNA的输出和翻译,而 Trf4/5介导的ncRNA多聚腺苷酸化能促进外泌体的降解。使用纳米孔直接 RNA 测序技术,作者破译了相关外切核酸酶、去腺苷酸酶和poly(A)聚合酶在缺陷型酵母中的poly(A)尾动力学。在酵母细胞种,ncRNA poly(A) 尾长主要在 20-60 个腺苷,新转录产生的mRNA+ Poly(A) 尾平均长度为 50 个腺苷,上限为 200个腺苷。通过Trf5介导的核外泌体和细胞质去腺苷酸化酶进行核酸外切,平均将poly(A) 尾修剪为 40 个腺苷。PAN2/3 和 CCR4-NOT 脱腺苷酶复合物具有大量非重叠底物,主要由表达水平决定。最后,作者证实了mRNA poly(A) 尾长对生长条件应激反应,如温度和营养缺陷等。

 

研究思路

 

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结果

 

1.纳米孔直接RNA测序有效预估酵母细胞RNA中mRNA 丰度和 poly(A) 尾长度

作者采用纳米孔直接RNA 测序技术对通过oligo-(dT)25 珠子捕获的分级poly(A)+ RNA 进行测序从而确定酵母细胞中RNAs poly(A) 尾长及丰度。此类RNA能有效除去非多聚腺苷酸化 ncRNA,并基于与 (dT)10连接适配进一步通过逆转录生成RNA-cDNA 杂交链,从而制备文库底物(图 1a) 。

 

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图1. RNA poly(A)尾长与RNA表达负相关

 

ONT直接RNA测序技术使用指南中建议使用 oligo-(dT) 25 珠子进行poly(A) + RNA 选择,以获得足够量的 RNA (50–200 ng) 用于文库构建,并从丰富的 ncRNA (rRNA) 中去除不带ploy(A)尾的样本,避免此类RNA由于二级结构堵塞纳米孔。作者试图用这种方法区分是或否未寡聚腺苷酸化的转录本,并对其进行量化。为了评估poly(A) +在富集过程中可能丢失的寡聚腺苷酸化 mRNA 水平,作者通过人工合成掺入poly(A)+ RNA 样本进行直接RNA测序。Poly(A) +与总的DRS数据集在 mRNA 丰度和 poly(A) 尾长方面彼此密切相关(图 1b),但总 RNA 数据集主要分布的poly(A) 尾reads大多短于 10 As(补充图 1h)。此外作者还发现,与 poly(A) + DRS 组相比,高表达的转录本尤其富含短poly(A)尾的RNA,导致平均 poly(A) 尾长预测长度变短,同时丰度略有增加(补充图 1i),其结果也通过逆转录 qPCR交叉比较得到验证(补充图 1j)。总的来说,这表明每个mRNA都有一个单独的低聚腺苷化物种。然而,作者只发现了840种短的ploy(A)尾RNA 能够强烈影响平均poly(A)尾长和丰度(补充数据1)。由于poly(A)+fraction被证明是一个很好的近似总类型RNA模拟样本,因此作者使用可以进一步进行实验分析。

 

2.mRNA poly(A) 尾长与转录本丰度负相关,与转录或翻译率无关

在 30 °C 或 25 °C 的稳态生长条件下,从 野生型WT BY4741 和 W303 酵母分离株中筛选的poly(A) + RNA 的平均poly(A) 尾长及中位数分别为 40 和 37 As。然而poly(A) 尾长在各个转录本间存在显着分布差异(图1c)。高表达的mRNA具有相对短的尾部,平均数数及中位数分别为30As和26As。相比之下,表达较低的所有转录本(mRNA 和 ncRNA)的 poly(A) 尾长在 30 到 60 As 之间变化。随着 mRNA 丰度的降低,poly(A) 尾长的这种异质性逐渐增加。随后作者为了确定稳态下影响平均mRNA poly(A) 尾长的因素,将DRS 数据集与已发表的描述转录本生物发生和功能相关的数据进行交叉分析比较,发现mRNA的合成速率最合适定义DRS mRNA相关丰度,但与平均poly(A)尾长相关性较差34 - 36(图 1d)。在稳定状态下,平均 poly(A) 尾长也不与 mRNA 半衰期相关 (图1e),每个细胞的蛋白质分子数量与 mRNA 丰度密切相关,并与平均 poly(A) 尾长负相关(图1f),推测后者可能是共翻译 mRNA 去腺苷酸化的标志。然而,在考虑翻译效率时,这种相互依赖性实际上已经消失了(图1f)。 鉴于这些结果,作者提出假设:mRNA poly(A) 尾长可能由核酸外切导致,且至少部分独立于翻译。

 

3.Pap1 产生的 poly(A) 尾大多数为 50 As,最长为200 As,而 Trf4 可以部分补偿其消耗

为了定义核酸外切的程度,作者首先试图先确定从头产生的 poly(A) 尾的长度。稳态下 Poly(A) 尾长是核聚腺苷酸化的功能性指示,推测主要是细胞质去腺苷酸化。随后通过阻断核输出,尽量减少去腺苷酸化对新产生的 mRNA poly(A) 尾长的影响。如先前所示mft1Δ突变酵母细胞中,输出途径在高温下受损,另外在耗尽的 Mex67 的细胞中,使用锚定-(AA) 系统使输出途径完全受阻(图 2a)。通过将细胞从 25°C 快速转变为 38°C 持续 12-15 分钟,从而允许从头产生一组热应激产生的 mRNA,在两种输出途径阻断的菌株中,mft1Δ和 Mex67-AA  poly(A) 尾平均长度为 50 As(mft1Δ 47As,Mex67-AA 51As ,图 2a )。与对照组mRNA的poly(A尾长相比,最大上限在Mex67缺失的细胞是200 As,在mft1Δ大约163As(图 2a、b) 。

 

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图2. Pap1 产生的poly(A)尾大多数为50As,最长为200As,并且Trf4能部分补偿其消耗

 

为了评估核poly(A)聚合酶 Trf4 在 mRNA poly(A)尾的生物学发生中的作用,作者 采用Pap1活性抑制的的热敏pap1-1突变体进行研究。如先前所示,pap1-1中核外泌体亚基RRP6的缺失导致pap1-1细胞在28.5°C下热敏性受到抑制(图 2c)。作者提出假设pap1-1中部分外泌体失活为非标准的poly(A) 聚合酶提供了结构空间,并通过腺苷酸化使mRNA恢复其功能。事实上,TRF4缺失加剧了pap1-1细胞的生长缺陷,并且不支持 mRNA 稳定性 (图2c)。因此,作者对来自相关菌株的poly(A) RNA 进行了测序,并使用RT-qPCR来归一化DRS数据集。在pap1-1突变体中,mRNA poly(A) 尾长缩短与对照组细胞中的 poly(A) 尾长度成正比,表明该突变损害了聚合酶的持续合成能力。而在pap1-1、pap1-1 rrp6Δ和pap1-1 trf4Δ背景中,mRNA poly(A) 尾分别显着缩短 了6.86、3.73和 7.66 As (图 2d,蓝色所示)。因此,在Pap1-1株中,RRP6 的缺失导致诸如细胞生长、mRNA丰度和 poly(A) 尾长部分恢复。由于在trf4Δ 中并没有观察此类结果,作者得出结论,该恢复机制可能主要与 Trf4/5 介导的多聚腺苷酸化有关,目前仅在外泌体缺陷株下可见。早期研究表明,腺苷酸化缺陷与转录本衰变之间存在相关性。尽管在结果分析中poly(A) +RNA的绝对水平证实了这一点,特别是高表达的mRNA,但作者发现在pap1-1, pap1-1 rrp6Δ以及 pap1-1 trf4Δ菌株中平均 poly(A) 尾长的绝对变化与RNA的丰度倍数变化之间没有全局相关性(图2e-h)。这表明某些mRNA 在pap1-1菌株细胞中被正确地腺苷酸化,并且稳定的mRNA丰度或/poly(A) 尾长是由其他核或细胞质补偿机制引起的。

 

4.ncRNA 具有长 poly(A) 尾,TRAMP5 协同 Rrp6 进行 mRNA poly(A) 尾修剪

为了评估核外泌体和 TRAMP4/5 对 poly(A) 尾生物发生和不同 RNA 生物型稳定性的直接影响,作者将 30°C 下生长的WT、trf4Δ、trf5Δ和rrp6Δ菌株通过ONT直接RNA测序生产数据集,然后检查主要的外泌体靶标核 ncRNA。与 WT 相比,在rrp6Δ数据集中映射到 CUT、sn-/snoRNA 和 rRNA 基因座的reads数总和显着增加(图3a),且检测非多聚腺苷化的ncRNA (如25S rRNA、SCR1和LSR1)的腺苷酸化增加,此前已被报道并通过RT-qPCR进行验证(图3a)。

 

另外还测到了大量其他ncRNA。尽管预计Trf4/5 会将 ncRNA 寡聚腺苷酸化,但令作者惊讶的是,在 rrp6Δ细胞中,CUTs、sn-/snoRNA 和 rRNA 的 poly(A) 尾中平均长45、54和 52As。在WT 菌株中也检测到同样长度的poly(A)尾(图3a)。作者还观察到ncRNA 腺苷酸化部分依赖于Trf4,表现为trf4Δ和rrp6Δ trf4Δ数据集中的平均 poly(A) 尾长度和丰度(图 3a),并通过Northern 印迹分析验证。与 TRAMP5 在形成成熟rRNA作用一致,trf5Δ细胞中许多rRNA前体丰度和 poly(A) 尾长度都有所减少(图3a)。

 

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图3. Trf5激活外泌体剪切mRNA poly(A)

 

RRP6或其辅因子TRF4或TRF5的缺失不影响蛋白质编码基因的丰度。然而,在rrp6Δ和trf5Δ细胞中poly(A) 尾分别平均为3.4和4As。大多数受影响的 mRNA 以低或中等水平表达,并且在 WT 细胞中具有中长的 poly(A) 尾。这些结果表明 TRAMP5 在外泌体修剪 mRNA poly(A) 尾部过程中起作用。基于总 RNA fraction和 Northern 印迹分析,作者验证了RPL18B mRNA以及TDH3 mRNA的 poly(A) 尾长度的变化,在所有缺失RPL18B菌株中都具有延长的 poly(A) 尾,而在缺失TDH3菌株中很大程度上保持不受影响(图 3d)。

 

最后,作者研究了rrp6Δ细胞中的某些 mRNA poly(A) 尾伸长是否可归因于 TRAMP4 介导的腺苷酸化。发现rrp6Δ菌株(绿点)中具有至少 10 As 长的 poly(A) 尾的许多mRNA在rrp6Δ trf4Δ双突变菌株中趋于缩短,与 WT 相比,rrp6Δ trf4Δ双突变菌株中mRNA 的 poly(A) 尾长仍然整体延长了2.3 倍(图3b)。这表明表明 TRAMP4 确实使它们产生聚腺苷酸化。然而,rrp6Δ中的 poly(A) 尾部伸长不仅与 Trf4-聚合酶活性的激活有关还可能与其他机制相关。

总的来说,这些结果表明一些 mRNA 的 poly(A) 尾巴的长度受 Rrp6 调节,主要是由于 TRAMP5 增强的 poly(A) 尾巴的核酸外切修剪。然而,一些 mRNA 的腺苷酸化可能由 TRAMP4 执行。

 

5.Dis3 和 Rrp6 均介导广泛的 mRNA poly(A) 尾修剪和降解

与 Dis3 相比,Rrp6 仅赋予一种非必需的外泌体核活性。为了确定外泌体活性的全部程度,作者使用锚定-AA系统在 30°C 下同时从细胞核中消耗 Dis3 或 Dis3 和 Rrp6 40分钟,然后通过ONT直接RNA测序生产数据集。发现DIS3-AA和DIS3-/RRP6-AA细胞中更高水平的 CUTs、snRNA 和 rRNA 前体。在双耗竭菌株中,CUTs 具有 56 个 As 的 poly(A) 尾和 63 个 As 的 snRNA 和 rRNA 尾(图 4a)。在某些 snRNA 位点,转录终止可由 CPF 和 NNS 介导。因此,这些长 poly(A) 尾巴可能归因于 Pap1 活动。然而,作者发现核 ncRNA 的 poly(A) 尾部在pap1-1 rrp6Δ菌株中约为 37 As (图 4a),证实TRAMP可以产生长度与 mRNA 相当的poly(A)尾。平均 mRNA poly(A) 尾长从WT中的40 As分别增加到 DIS3-AA和DIS3-/RRP6-AA细胞中的47 和 56 As (图 4b、c)。无论它们在 WT 株中的 poly(A) 尾长如何分布,绝大多数中度至最低表达的 mRNA 都受到影响。相比之下,高表达的 mRNA 的 poly(A)尾长受影响较小(图4b, d)。因此,与rrp6Δ突变株相类似,在DIS3-AA和DIS3-/RRP6-AA细胞中,TDH3 mRNA的 poly(A) 尾长几乎没有变化。虽然所有的消耗都显着增加了RPL18B mRNA的 poly(A) 尾长度(图 4e)。在 Dis3 和 Dis3/Rrp6 耗尽的细胞中,很大比例的 mRNA 被上调,但转录物的稳定性与 poly(A) 尾长变化无关(图4d)。由于细胞质外泌体辅助因子 Ski2 解旋酶的缺失不会导致 poly(A) 尾长的显着变化,而只会导致 mRNA 稳定性的微小变化(图4b, d),作者得出结论,Dis3 和 Rrp6 调节 mRNA 稳定性和 poly(A) 尾长,主要在细胞核中。

 

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图4 Dis3 和Rrp6介导广泛的mRNA poly(A)剪切

 

6.PAN2/3 和 CCR4-NOT细胞质去腺苷酸酶的靶向不同的转录本和重叠区

细胞质 mRNA 衰减受 CCR4-NOT 和 PAN2/3 脱腺苷酸酶复合物调节。作者对每个复合物ccr4Δ和pan2Δ的催化亚基缺失菌株的poly(A) + RNA 进行了测序。在pan2Δ和ccr4Δ突变菌株中观察到 mRNA poly(A)结构显著地延长分别平均 7.17 和 6.66 As,而表达水平没有重大变化(图 5a )。PAN2/3 和 CCR4-NOT 活性针对不同的底物组,平均 poly(A) 尾部变化相关性很差(图 5b)。因此,Pan2 似乎优先靶向高丰度和中等丰度的 mRNA,并且其对 poly(A) 尾长的影响随着转录表达水平的降低而降低,而在Ccr4 菌株中观察到相反的趋势(图 5c)。为了进一步验证所提出的结论,对所有 mRNA poly(A) 尾部的核酸酶进行敏感性检测,发现 61.8% 的注释 mRNA 和 82.6% 的 mRNA 可以被 DRS 检测到核/或细胞质去腺苷酸化的底物(图 5d)。这些结果共同表明,外切核酸酶对 mRNA poly(A) 尾长的调节是一个多步骤的、底物特异性过程,发生在细胞核和细胞质间隔中。

 

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图5. PAN2/3 和CCR4-NOT细胞质去腺苷酸化复合物能够靶向不同的转录本

 

7.转录本 poly(A) 尾长较大程度上取决于生长条件

生长条件会改变 mRNA 转录和衰减的速率。因此,作者比较了在 25°C 和 30°C 稳态生长的细胞与在 38°C 下热应激 12 分钟或在 37°C 下热应激 1 小时的细胞的poly(A)尾长分布图(图 6a)。在 30 °C 和 25 °C 下,mRNA 丰度和 poly(A) 尾长相当。相比之下,12 分钟的热应激降低了高表达的 mRNA 的丰度和缩短的 poly(A) 尾。奇怪的是,与 25-30°C 条件相比,在37°C 下孵育 1 小时高度和中度表达的 mRNA其丰度和全部延长的 poly(A) 尾有所增加。为了检查一些功能组,作者补充实验选择了被热应激上调或下调超过五倍的 mRNA,发现上调伴随着 poly(A) 尾巴伸长,而下调的转录物平均具有较短的尾巴。下调的 mRNA 似乎强烈依赖外切核酸酶来调节其丰度,因为其中 88% 是外泌体或去腺苷酸酶的靶标,而在上调的情况下,这一比例为 34%(图6c)。

 

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图6. 转录本 poly(A) 尾长取决于生长条件

 

此外,为了评估营养成分对 mRNA 和 poly(A) 尾代谢的影响,作者比较了在含有葡萄糖作为碳源的丰富培养基中生长的细胞获取的DRS 数据集与含有棉子糖和半乳糖的基本培养基中生长的细胞的获取的 DRS 数据集(图6d)。在基本培养基中 25 °C 时,mRNA,无论丰度如何,通常都含有短的 poly(A) 尾,因此 poly(A) 尾的长度与丰富培养基中表达水平之间的相关性几乎消失(图 6d)。作者推测这种效应不能归因于Pap1活性降低,因为无论生长条件如何,新产生的 mRNA 的 poly(A) 尾都具有可比的大小(图2a、b)。与丰富培养基相比,在基本培养基中生长的细胞中高表达的 mRNA 占所有 mRNA较小份数。在基本培养基+热休克后,这些 mRNA 的丰度进一步降低,尽管对 poly(A) 尾长没有强烈影响。总的来说,生长条件尤其是营养来源,对 mRNA 表达和 poly(A) 尾长度分布谱具有重大影响。

 

讨论

 

文章通过ONT直接RNA测序数据集进行全面地分析了转录后 mRNA 和 ncRNA poly(A) 尾生物发生机制,该机制的响应受到生长条件的调节,并证明核和细胞质核酸酶在该过程中发挥重要作用(图7)。

 

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图7. 转录后mRNA poly(A)尾长在细胞核和细胞质中存在广泛的调控

 

ncRNA poly(A) 尾的生物起源仍不清楚,因为聚腺苷酸化和降解同时存在。广泛接受的模型TRAMP4/5 介导的寡聚腺苷酸化通过募集外泌体/Rrp6 复合物来增强衰变,而由Pap1介导的poly(A)加长并促进稳定性增加和输出。文章结果与该模型并不完全一致,该研究显示核ncRNA与 mRNA 的具有相当的 poly(A) 尾长,即使在Pap1受损的细胞中也如此。TRAMP4/5、外泌体和 NNS 复合物在功能上和物理上相互作用,但作者认为不因以形成一个大的稳定复合物去看待。相反,应以概率的方式考虑这些复合体中的每一个因子的作用。

 

mRNA poly(A) 尾巴的核生物发生似乎没有争议。裂解和聚腺苷酸化是耦合的,并被认为与核输出紧密合作。因此,mRNAs 似乎逃脱了核降解,只受细胞质衰变的影响。这一观点源于 Blobel 于 1985 年提出的挑衅性基因门控假说,并且被证实该观点仅适用于响应生长条件而上调的某些 mRNA 。单分子转运研究表明,无论基因定位如何,mRNA 都可以在输出前长时间在染色质间隙内自由扩散。 根据基因的核定位,一些 mRNA 可以具有更长的核驻留时间,从而有足够的时间成为外泌体及其 TRAMP4 和 TRAMP5 辅因子的靶标。文章作者发现具有中低表达的 mRNA 是最突出的外泌体/TRAMP4/5 靶标,推测外泌体介导的核酸外切和 TRAMP4/5 再腺苷酸化可能会影响某些 mRNA 的输出速率,为此需要严格长度的 poly(A) 尾(图 7)。

 

作者给出的数据显示,在稳态下CCR4-NOT 和 PAN2/3 细胞质去腺苷酸酶复合物都具有大量不重叠的靶标,并且检测到10.9%的mRNA 有共享底物冗余。这一研究改进了双相 mRNA 去腺苷酸化模型,该模型假设初始去腺苷酸化是由 PAN2/3 介导作用,然后是CCR4-NOT 介导完成。同时该研究结果还指出,即在初始阶段,两种复合物根据其底物特异性独立运作。PAN2/3募集非特异性mRNA ,并依赖于聚腺苷和 Pab1 的结合。 高表达的mRNA约占所有蛋白质编码分子60%,这些是最常见的 PAN2/3 靶标。相比之下,CCR4-NOT 复合物除了与 Pab1 结合外,还通过适配蛋白靶向其底物,并加速去腺苷酸化,从而使这种去腺苷酸酶复合物更倾向于靶向mRNA。CCR4-NOT 也可直接去As,表明这种复合物的招募与随后的衰变更紧密地联系在一起.。由于检测寡聚腺苷酸 RNA 的限制,目前作者的研究数据无法完全解决这一方面。

 

参考文献

Tudek et al., Global view on the metabolism of RNA poly(A) tails in yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature communications. 2021

 

 

 

 

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