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文献解读|ONT Long-reads组装六倍体小麦基因组助力小麦研究和育种

由于小麦(Triticum aestivum)是六倍体,且基因组较大(15.5G)、重复序列多,导致组装完整的小麦基因组是一个方法学的难题。2018年在短读长测序与其他技术相结合的巨大努力下实现了“中国春”小麦品种基因组的组装,为小麦研究提供了参考基因组。随着测序技术的快速发展及成本降低,使用低成本获得高质量基因组便不再是奢望。

 

该研究利用Oxford Nanopore(ONT)测序技术,组装了迄今为止最连续、最完整的法国六倍体小麦Renan的基因组,有助于快速选择重要的农艺性状,该研究还提供了利用ONT测序数据组装高质量复杂基因组的分析方法。

 

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文章标题:Long-read and chromosome-scale assembly of the hexaploid wheat genome achieves high resolution for research and breeding

发表期刊:bioRxiv

发表时间:2022.02.03

 

主要研究结果:

 

1. 基因组测序和光学图谱

使用20张ONT芯片(2个MinION和18个PromethION)进行基因组DNA测序,共获得约63x ONT数据,reads N50为24.6 kb,其中有3.1M的reads长度超过50kb。使用Bionano构建光学图谱,同时构建了4个Hi-C文库,用于构建Hi-C map。

 

2.基因组组装

该研究使用多款组装软件进行组装尝试,并指出SMARTdenovo与Flye的组装结果有高度相似性,而SMARTdenovo的组装大小更接近于预估基因组大小,组装结果contig数也较少,即连续性更高(14.1 Gb,contig N50=1.8 Mb)。

 

对纠错后的组装结果进行评估,最终选择SMARTdenovo的组装结果进行后续研究,并使用BiSCoT软件解决了局部contig重复,将contig N50提升到2.1 Mb。使用Hapo-G软件进一步优化,最终组装出14.26Gb小麦基因组,scaffold N50为48 Mb。

 

图1 六倍体小麦21条染色体基因组特征展示

 

3.组装质量评估

使用Mercury和Illumina reads来评估组装质量,得到平均质量值QV为32.8,低于使用Illumina reads组装的RefSeq v2.1基因组,表明单碱基质量仍是问题,但由于低重复区域存在,编码区可能会有更高的精度。此外,该研究在21条染色体中搜索TTTAGGG端粒重复序列,并在染色体7A两端发现了端粒重复,表示7A染色体组装完整。

 

表1 小麦基因组组装比较

 

4.转座元件和蛋白编码基因注释

该研究使用小麦特有TE库ClariTeRep对基因组中TE进行注释,共注释到12G TEs,占组装大小的84%。

 

表2 中国春小麦和Renan小麦基因组的TE分类比例

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5.与现有的六倍体基因组组装进行比较

该研究将长读组装与其他几个可用的小麦染色体级别基因组进行比较,发现基于短reads组装的结果连续性较低(图2A-C)。比较不同组装的染色体长度,发现SY_Mattis在染色体5B和7B之间发生易位(图2D)。

 

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图2 现有的六倍体小麦基因组组装比较

 

6.小麦基因组基因渐渗及育种相关基因研究

该研究分析发现,在LongRead Lancer中存在两处基因渐渗,在Ae. Ventricosa的2A染色体中存在两处基因渐渗(图3A,B)。

 

此外,编码贮藏蛋白omega-gliadins的基因不仅存在串联复制,且在编码部分还由微卫星DNA组成,短读组装很难将该片段组装出来,而利用ONT测序技术,使得新组装的Renan基因组在该区域只有3个gap。与小麦抗病相关的基因Sm1,在新的组装结果中也具有较高的连续性,对后续小麦育种研究起到重要的推动作用。

 

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图3 小麦染色体中的单倍型块展示

 

总结:

 

该研究利用ONT测序产生超长reads的优势,组装了目前最为完整的复杂的六倍体小麦基因组,基于此基因组进行了基因渐渗分析和育种基因的研究,为小麦育种工作奠定了坚实基础。此外,该研究指出,对于复杂基因组而言,ONT长读长的优势是PacBio- HiFi无法达到的,目前仍需要结合ONT和Ilumina测序技术,提高组装的单碱基准确度。

 

文章链接:

doi: https://doi.org/10.1101/2021.08.24.457458

 

 

 

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