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项目文章 | NC-核苷类细胞分裂素狭霉素A的高效生物合成


2021年11月17日,武汉大学组合生物合成与新药发现教育部重点实验室陈文青教授课题组联合上海交通大学微生物代谢国家重点实验室,在期刊Nature Communications(IF=14.919/Q1)在线发表“Efficient biosynthesis of nucleoside cytokinin angustmycin A containing an unusual sugar system”研究论文,该研究破译了新型绿色植物细胞分裂素—狭霉素A的生物合成机理。贝纳基因有幸承担了该研究中放线菌基因组的测序和分析工作。下面就随小编一起学习狭霉素A分子的生物合成背后的逻辑吧~

 

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文章概述

 

狭霉素A具有抗分枝杆菌和细胞分裂素的生物活性,其糖环单元上的双键结构非常罕见。本研究成功克隆该抗生素的生物合成基因簇,并确定有9个基因负责其生物合成,进一步破解了狭霉素A生物合成中最后一步脱水反应的酶促反应机理,揭示AgmF可以通过一种自给自足策略来实现辅因子循环。此外,在体外重构了狭霉素A的生物合成途径,并实现了其高效的工程化产生。本研究的结果扩展了天然产物生物合成的酶学库,也为深入揭示核苷类细胞分裂素的生物合成与产业化应用奠定了坚实的基础。

 

研究策略

 

1. 菌株基因组测序分析(Nanopore和Illumina Hiseq2500)

2. agm基因簇的克隆及其变异体构建

3. 狭霉素的发酵及检测

4. AgmF结构模型的建立与分析

5. AgmA-AgmF的体外检测

6. 化合物1和2的一步法生物合成反应

 

主要研究结果

 

1、S. angustmyceticus JCM 4053中狭霉素基因簇的鉴定

对两株独立的狭霉素产生菌Streptomyces angustmyceticus JCM 4053和Streptomyces decoyicus NRRL 2666进行基因组的测序及分析,并通过液相色谱-质谱验证了其生产狭霉素的能力。通过BlastP在S. angustmyceticus JCM 4053基因组中发现了5个候选酶,这些基因的周围区域显示一个基因簇(agm)。此外,在 S. decoyicus NRRL 2666 基因组中鉴定出具有显著同源性的同源基因簇,表明靶基因簇(agm)可能直接负责狭霉素的生物合成。

 

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图1狭霉素生物合成基因簇的遗传组织和验证

 

2、基因簇agm是狭霉素生物合成所必需的

分析揭示了一个目标9.8 kb区域,包含9个被推断参与狭霉素生物合成的基因。其中,AgmT1和AgmT2被认为发挥将狭霉素输出细胞的功能性作用,AgmR可能通过在狭霉素生物合成过程中与启动子区域结合而发挥调节作用。

 

3、AgmA起AMP磷酸核糖水解酶的作用

过表达AgmA并转化大肠杆菌,使用AMP/dAMP作为底物测试体外活性。HPLC结果表明AgmA能够消耗AMP/dAMP作为底物以产生腺嘌呤的特征峰,并且AgmA酶也可以将ATP、ADP和dADP识别为底物。这些数据确定AgmA作为AMP磷酸核糖水解酶提供腺嘌呤。9058个AgmA同源物的序列相似性网络(SSN)分析结果表明,这些同源物更广泛地分布在细菌基因组和植物基因组中。放线菌来源的相关酶,包括本研究中描述的AgmA也聚集在网络中。

 

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图2 AgmA作为AMP磷酸核糖水解酶的功能表征

 

4、狭霉素A的生物合成有特殊的最终脱水步骤

AgmF被注释为S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶,通常催化SAH可逆水解为腺苷和同型半胱氨酸。将AgmF在大肠杆菌中过表达和纯化,结果表明,AgmF能够在不添加外源性NAD+辅因子的情况下保持活性,这意味着AgmF是一种自给自足的酶。为了检验这一假设,对AgmF酶进行热处理以释放潜在的辅因子,然后通过HPLC和LC-MS鉴定NAD+峰。并且底物2在AgmF反应中没有被用完,这意味着AgmF酶可能催化从1到2的可逆反应。综合数据表明,AgmF作为一种不寻常的NAD+依赖性脱水酶发挥作用。

 

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图3 AgmF作为催化可逆反应的不寻常脱水酶的功能表征

 

5、在体外重构化合物1和2的六酶催化合成途径

为了进一步破译化合物1生物合成逻辑,在体外重建了1的完整生物合成途径。覆盖AgmA-F的六种酶分别过表达并从大肠杆菌中纯化,允许从头构建生物合成途径。产物的HPLC分析表明,完整的AgmA-F反应能够产生独特的2、腺嘌呤和1峰,这些数据表明,六种酶(AgmD、C、A、E、B和F)催化以果糖6-磷酸作为起始底物在狭霉素生物合成中的中间反应。

 

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图4 整个1生物合成途径的体外重构

 

6、利用大肠杆菌作为细胞工厂生产化合物1和2

最后,还探索了利用大肠杆菌作为细胞工厂生产化合物1。6种生物合成基因(agmDCAEBF)导入大肠杆菌。HPLC显示转化体GYJ23/agmDCAEBF能够产生化合物1和2的目标峰,并通过LC-MS分析进一步证实。发酵96h后,化合物2和1的产量可分别达到110和370μg/mL。有趣的是,研究发现菌株(GYJ23/agmDCAEB,缺乏agmF)在发酵96小时后能够以420μg/mL的产量靶向积累化合物2。

 

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图5 大肠杆菌中2和1的工程化产物

 

参考文献

Yu, L., Zhou, W., She, Y. et al. Efficient biosynthesis of nucleoside cytokinin angustmycin A containing an unusual sugar system. Nat Commun 12, 6633 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-26928-y

 

 

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