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项目文章 | Nanopore Direct RNA测序揭示表观遗传在中华鳖性逆转中的重要作用

中华鳖是一种经济价值较高的水生动物,具有明显的性别二态性特征。雌二醇或甲基睾酮等外源激素可以在不改变基因型的情况下诱导性逆转,形成新的表型。该研究采用Nanopore Direct RNA测序技术研究中华鳖性别相关的转录组复杂性。作者全面分析了可变剪接事件和RNA甲基化修饰,如m6A和m5C,揭示了生物表观遗传在中华鳖性腺发育中的重要作用。贝纳基因参与了Direct RNA测序和分析工作。

 

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文章标题:Direct Full-Length RNA Sequencing Reveals an Important Role of Epigenetics During Sexual Reversal in Chinese Soft-Shelled Turtle

发表杂志:Frontiers in Cell and Developmental Biology(IF=6.684)

发表日期:2022.3.25

 

材料

 

使用外源激素雌二醇或甲基睾酮刺激中华鳖性腺分化阶段的胚胎,获得假雌性(PF)和假雄性(PM)个体,分别对雌性、雄性、PF和PM中华鳖性腺组织样品,每组各取3个重复,进行Nanopore Direct RNA测序。

 

主要结果

 

不同样本的Direct RNA测序数据统计

共获得62672条clean reads,99.19%可以比对到中华鳖基因组(版本1.1)(图1A)。每种性别获得了超过150万条reads,测序数据具有较高的深度和可信度,M组和PM组在reads长度和转录本的整体表达水平上与F组和PF组不同。

 

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图1 不同样本的Direct RNA测序数据统计

 

性别类型的转录本结构分析

共鉴定到5种新的转录本类型(O、J、X、I和U),包含16077个转录本(图2A、B)。LncRNA预测分析(图2C),发现M与PF和F与PM中差异表达的LncRNA富集在许多生物学过程。Poly(A)尾长分析,发现在4个性别类型之间Poly(A)尾长度分布不同,但在每个类型内保持一致(图2D)。

 

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图2 中华鳖性别类型转录本的结构分析

 

可变剪接分析发现,在F和PM之间,可变剪接位点的数量存在显著差异,尤其是3′端可变剪切、5′端可变剪切和第一个外显子可变剪切数量在F到PM的性逆转过程中显著减少(图2E),在M到PF的性逆转过程中显著增加(图2F)。

 

性别类型间差异基因表达分析

通过差异基因分析,发现在M和F或M和PF之间发现了约15000个差异表达基因,而在雌性个体和雄性表型个体之间发现了12000个差异表达基因。同一性别(M和PM;F和PF)之间差异表达的基因数量较少(图3A)。

 

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图3 性别类型之间的差异基因表达分析

 

将差异基因分为两组进行分析,韦恩图分析确定的这两组中差异表达基因的数量(图3B、C)。对两组中的差异基因进行聚类和GO,KEGG富集分析(图3E、G),第一组中大部分上调的差异基因参与核内体膜、细胞钙离子稳态和自噬体相关的过程。下调的差异基因主要集中在嘌呤代谢和亨廷顿氏病信号通路。第二组的差异基因主要富集于囊泡介导的转运、运动纤毛和多种信号通路。

 

中华鳖性别类型的甲基化分析

m6A修饰的转录本的分布和整体表达水平如图4A所示。F表型的表达量显著高于M表型。Poly(A)长度与m6A修饰的转录本的相关性分析表明,雌性表型样本(F和PF)与雄性表型样本(M和PM)之间存在显著差异(图4 b)。比较不同组间m6A修饰的motif,发现组间没有显著差异(图4C)。但是基于m5C和m6A甲基化修饰位点总数,外源激素诱导的个体甲基化修饰位点较少(图4D)。

 

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图4 中华鳖性别类型的甲基化分析

 

m5C和m6A甲基化修饰位点在基因结构上的分布结果表明,在由M到PF的性别逆转过程中,甲基化修饰位点的位置分布由CDS区占主导变为3'UTR区占主导(图4E,F)。PF在甲基化修饰方面更类似于F,而PM更类似于M。

 

性别类型的m6A修饰基因分析

通过对两组间m6A修饰基因的差异表达分析(图5A,B),在F与PM组中鉴定了1038个上调和1743个下调的m6A修饰基因,而在PF与M组中鉴定了1279个上调和880个下调的m6A修饰基因。

 

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图5 性别类型的m6A修饰基因分析

 

对两组差异基因的GO富集分析显示,运动纤毛、轴丝和线粒体外膜的基因显著富集(图5C,D)。KEGG富集分析显示,吞噬体、甲型流感和内质网中的蛋白质加工途径显著富集(图5E,F)。表明,类似的生物过程在两个方向上都推动了性别逆转。

 

甲基化修饰位点的染色体定位

使用MEME分析了m5C和m6A甲基化位点周围5 bp的序列特征(图6A,B)。结果表明,m5C motif的第二个碱基在雄性表型和雌性表型之间发生了变化,而m6A motif没有变化(图6B)。

 

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图6 甲基化修饰位点的染色体位置

 

图6C显示F到PM和M到PF两种性逆转途径中鉴定的差异m5C和m6A修饰基因在染色体上的位置。这些基因主要位于7条染色体上,表明这些甲基化染色体可能在两个方向上都与性别分化密切相关。

 

性别相关基因m6A甲基化修饰位点的验证

作者通过抗体富集含有m6A甲基化的RNA片段,反转录成cDNA之后,使用qRT-PCR验证m6A甲基化片段的表达。结果显示,从M到PF的过程中,Odf2、Pacs2、Ak1Ube2o的m6A甲基化水平显著降低,而从F到PM的过程中,Odf2、Pacs2、Ak1的m6A甲基化水平升高,Ube2o的m6A甲基化水平降低(图7A-F)。表明这些基因的RNA甲基化水平变化在性逆转过程中起着重要作用。

 

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图7 性别相关基因m6A甲基化修饰位点的验证

 

图7G展示了两种性逆转方式差异的示意图。可变剪接的数量、RNA甲基化(m5C和m6A)的位置以及关键基因的m6A甲基化水平在性逆转过程中具有显著变化,表明表观遗传学研究在性逆转过程中起着不可或缺的作用。

 

讨论

 

该研究应用Nanopore Direct RNA测序技术研究中华鳖转录组的复杂性。与M表型相比,F表型可变剪接差异显著。m5C和m6A两种RNA甲基化修饰在不同性别表型之间存在差异,并对关键基因的m6A甲基化水平进行了验证。该研究揭示了生物表观遗传在中华鳖性逆转过程中扮演的重要作用。

 

参考文献

Tong Zhou, Guobin Chen, Meng Chen, Yubin Wang, Guiwei Zou, Hongwei Liang. Direct Full-Length RNA Sequencing Reveals an Important Role of Epigenetics During Sexual Reversal in Chinese Soft-Shelled Turtle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2022. DOI: 10.3389/fcell.2022.876045

 

 

 

 

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