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文献解读|Nanopore测序超快速识别基因组致病变异


文章简介:

 

WGS在医疗诊断方面具有优势,但是其测序与下游分析的流程较慢。在本研究中,作者针对Nanopore在临床应用中的挑战,开发了一个全基因组Nanopore PromethION测序pipeline,改进了文库制备、基于云平台进行近乎实时的basecalling与比对、变异鉴定与过滤方法。本研究将该pipeline应用于临床诊断,在抽血后8 h内获得一个候选变异,相较于迄今为止最快的时间(样品制备到变异鉴定),缩短了46%-50%。

 

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标题:

Accelerated identification of disease-causing variants with ultra-rapid nanopore genome sequencing

期刊:

Nature Biotechnology(IF=54.908)

发表时间:

2022.03.28

 

主要研究结果:

 

(1) 超快速全基因组Nanopore测序pipeline

首先,为了能从有限的血液里提取DNA,本研究优化了标准的样品制备方案。同时,本研究测试了是否可以在减少文库数量的同时超过每个反应的推荐输入DNA量,发现将每个反应的输入DNA增加到4μg,并平行制备8个反应时,可获得16μg的最佳文库产量,此时flow cell可装载多达333ng的文库。

 

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图1 超快速全基因组Nanopore测序pipeline

 

为了降低成本,本研究将一套48 flow cells用于多个样品,并在每次测序后用标准核酸酶洗涤去除DNA文库。由于DNA barcode需要额外的清理,增加了时间成本,并减少了每个flow cell可装载的DNA数量,因此作者对barcode是否是必要的进行了评估,发现有无barcode的样品测序产量、变异鉴定方面没有明显差异。基于以上评估,后续研究去掉了barcode,并发现总的文库制备时间减少了37分钟,下游的测序效率也因此提高。

 

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图2 barcode评估

 

为了解决在实时basecalling与alignment方面的限制,作者开发了一个云平台,并在多个CPU上并行basecalling与alignment。虽然这种配置增加了额外的步骤,需要将TB级的原始信号数据从发射塔传输到云平台,但作者通过改进的fast5压缩文件(VBZ),调整每个fast5文件的读取次数,并切换到实时上传模式解决了这一问题。

 

上传与分配原始数据至16个计算进程,每个进程运行Guppy与Minimap2,并运行一组特定的三个flow cells。基于以上方法,作者利用HG002样本进行了测试,在16个进程并行运行的情况下,basecalling与比对文件的生成时间为25分钟。因此,高深度(200Gb)、长度长、全基因组的basecalling与比对在接近实时的情况下完成了。

 

接下来,作者改进了变异鉴定与注释的进程。将DeepVariant的CPU加速整合到PEPPER-Margin-DeepVariant pipeline中,将变异鉴定所需时间从40分钟进一步减少到23分钟;开发了一个定制的变异过滤模式,加速对变异的人工审查,目标是在已确定的疾病基因中轻易地选出具有明显致病性、可操作的变异。在上述方法下,HG002样本的候选变异数量从标准系统的101个减少到20个。

 

(2) Pipeline在临床中的应用

为了评估该pipeline在临床中的应用可能性,作者将该pipeline应用于一个57岁的危重病人与一个14个月大婴儿的基因诊断中。

 

57岁危重病人患有严重的SARS-CoV-2感染与并发症,在该pipeline应用实例中,从样本准备,到在TNN2基因中发现致病性杂合变异,一共耗时7.18h,此变异根据ACMG指南与美国医学遗传学被归类为可能致病。同时,此次诊断进一步减少了多次后续影像学研究与心脏活检的需要。

 

14个大的女婴有肌紧张和发育迟缓的病逝,fMRI显示脑室突出,可能是遗传病因。在该pipeline应用实例中,从抽血,到完成变异鉴定,一共耗时7h。在接下来的48分钟内,作者在LZTR1中发现了一个意义不明的候选变异,该基因被怀疑参与了高尔基体的稳定。该变异经过人工审查,最终确定任务致病性都不明确,正交的遗传学测试没有确定遗传病因。基于家庭的研究正在进行,以进一步确定改变异的任何潜在贡献。

 

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图3 pipeline在临床上的应用

 

总结

 

本研究中,作者开发了一种精简的Nanopore测序pipeline,该pipeline能够在<2小时产生高深度的人类全基因组数据,并在<8小时鉴定出候选变异,已被证明比先前报道的最快基因组诊断时间(14:33h)快50%。同时,该pipeline已被证明与42%的诊断率有关,该pipeline的应用将极大加速临床基因组测序的诊断。

 

参考文献:

SnehaD, et al. Accelerated identification of disease-causing variants with ultra-rapid nanopore genome sequencing. Nature Biotechnology. 2022.

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