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项目文章| Direct RNA测序揭示猪繁殖和呼吸综合征病毒的高分辨率转录图谱

摘要:

 

转录调控序列(TRS)介导的不连续转录过程是动脉炎病毒属的一个特征。使用短读测序很难重建和全面量化splicing events,使得TRS的识别尤其困难。本研究应用Direct RNA测序(DRS)来表征在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)早期传代感染期间在猪肺泡巨噬细胞中产生的重组RNA分子,发现PRRSV具有高分辨率和多样化的转录图谱。这项研究还确定了大量TRS介导的转录变体,包括编码相同注释ORF的替代性sg mRNA,同时阐明了甲基化和转录调控之间的潜在联系。本研究为重新定义PRRSV的转录组复杂性提供了有意义的见解,将有助于制定更好地控制PRRSV的策略。

 

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文章题目:Nanopore-Based Direct RNA-Sequencing Reveals a High-Resolution Transcriptional Landscape of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

发表期刊:Viruses

IF:3.816

发表时间:2021.12

 

研究背景

 

PRRS是过去三十年来全球养猪业经济最具威胁的传染病之一。致病因子PRRSV是一种新发现的单链正义RNA病毒,基因组长度约为15 kb,包含至少10个开放阅读框(ORF)。通过感染单核细胞-巨噬细胞系而使宿主发病。已完全测序的PRRSV菌株被证实具有相当大的遗传异质性和分类多样性。NGS虽然在阐明SHFV感染细胞的转录组学方面发挥了重要作用,但无法准确鉴定具有完整3′和5′端的全长转录本,使得研究者很难确定sg-mRNAs结构或重组事件中的特定TRS类型。

本研究首次应用纳米孔平台以高分辨率转录本长度对PRRSV中产生的剪接事件进行深入表征,揭示了两种不同菌株感染猪肺泡巨噬细胞时的差异转录活性,提供了全面TRS位点的准确见解。

 

材料方法

 

材料:感染两种不同PRRSV的猪肺泡巨噬细胞。两个PRRSV分离株分别为XM-2020(MZ160905.1,谱系1)和GD(EU109503.1,谱系8)。

测序平台: Nanopore MinlON,Illumina NovaSeq 6000

 

主要结果

 

1、 中国PRRSV-2的流行现状及遗传多样性

利用96株参考菌株构建了PRRSV-2在中国的流行状况和遗传多样性系统发育树图谱,以探讨PRRSV分离株之间的遗传多样性。流行性PRRSV-2菌株表现出高度的变异性,可聚集成四个不同的谱系:谱系1(NADC30样)、谱系3(QYYZ样)、谱系5(VR2332样)和谱系8(JXA1样/HP-PRRSV)。系统发育研究表明,当前研究中使用的两个菌株XM-2020(GenBank:MZ160905.1)和GD(GenBank:EU109503.1)分别被指定为谱系1和谱系8(图1)。回顾性研究表明,谱系8的流行在2009年达到高峰,之后随着时间的推移而下降,而谱系1的发生率迅速增加。与先前传播的PRRSV株相比,新出现的变异被认为具有更高的谱系重组频率,从而影响病毒的毒力和临床结局。

 

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图1  II型PRRSV全基因组系统发育分析

 

2、 谱系1和谱系8 PRRSV分离株在PAM感染期间不同的转录活性

为了解码PRRSV在体外感染期的转录图谱,本研究评估了感染猪肺泡巨噬细胞12小时和对应未感染的样本中PRRSV的转录情况(图2)。

 

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图2 实验工作流程

 

XM-2020和GD样本,分别获得34061和4619个独特的转录本,其中7036和1240个嵌合RNA分别包含前导序列(图3A)。两个样本中最丰富的转录本长度集中在500-1000 nt间(图3B)。gRNA和sg mRNA在覆盖深度上存在差异,特别是在5’ UTR的前导序列后,覆盖深度急剧下降,在结构蛋白区域则逐渐上升(图3C)。PRRSV的高度转录组复杂性归因于多种类型的RNA剪接事件,大多数剪接体是不连续转录的产物,发生在上游5′UTR末端的前导序列和基因组(TRS-B)之间。规范剪接供体高度富集在注释的5’UTR端。比较转录组分析显示不同菌株的病毒复制和转录活性存在显著差异,XM-2020感染导致的转录活性似乎高于GD。

 

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图3 来自两个独立PRRSV分离株的测序数据

 

3、 可变剪切分析

纳米直接测序鉴定的大多数剪接事件可以很好的在Illumina数据中复现,包括polyA的分析结果(图4)。

 

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图4 高分辨率RNA图谱的多策略测序

 

尽管Illumina分析确定了更多的异构体,但它还不足以涵盖sg mRNA长度多样性的全部范围。绝大多数剪接体是由TRS-L和TRS-B之间的5′先导依赖性模板转换产生的(图5A,B)。进一步检查还发现存在三种类型的不连续转录事件,分类为TRS-L与罕见的3′剪接位点的融合、TRS-L独立的长距离融合(间隙大于1000 nt)和TRS-L独立的局部融合(间隙小于1000 nt)(图5A,B)。

 

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图5 全局RNA融合事件

 

不依赖于TRS-L的嵌合转录本以前并没有被认为是一个独特的群体,它们在XM-2020和GD之间差异表达(图6A-B)。这些异质亚群的5个剪接位点在转录不活跃的ORF1b上游更为富集,而3个连接位点则形成在转录活跃的TRS-B位点附近。评估这些事件与围绕断点位点的核苷酸偏好是否有关,对断点序列进行分析,观察到断点周围核苷酸的强烈偏好(图6C)。胞嘧啶(C)倾向于在断点的上游,而尿嘧啶(U)则倾向于在下游,表明这些特征可能参与了PRRSV sg RNA生成的机制。

 

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图6 TRS-L独立非规范事件的特征

 

4、 PRRSV基因组中TRS-B位点的鉴定

结合Nanopore和Illumina,在XM-2020和GD中分别鉴定了48个和18个TRS-B的高置信共享位点(图7B)。多个推测的TRS-B被定位到非结构蛋白区,这些长sg mRNA以“低”丰度表达,编码不同长度的N端截短多聚蛋白pp1a和pp1ab;其中大多数发生在ORF1b区域,而不是ORF1A区域。两种病毒都显示了这些独特的转录模式。TRS-B位点周围的侧翼残基分布,发现了局部位置特异性基序偏好,这些保守的侧翼残基可作为顺式肌动蛋白RNA元件,在sg mRNA合成过程中促进碱基配对和模板转换(图7C)。

 

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图7 TRS-B位点的全基因组分布

 

5、 基因预测和注释

XM-2020和GD转录组中分别鉴定出26和17种假定肽(图8C)。新发现一个在XM-2020中的替代性开放阅读框,具有较低的转录水平,编码N基因编码区内的37个氨基酸肽,命名为ORF7a。

 

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图8 PRRSV的编码基因预测和功能注释

 

6、 gRNA和sg mRNA的m5C位点分析

甲基化胞嘧啶(m5C)是转录后水平上基因表达的关键调节因子,在调节mRNAs的加工、稳定性和剪接方面发挥着关键作用。通过检测电压信号的偏差,Direct RNA-seq可揭示mRNA修饰的复杂性(图9A)。两种病毒在多聚poly(A)RNA中均表现出广泛的m5C。不同病毒中m5C的数量和分布模式存在显著差异,nsp2区域在XM-2020和GD中均表现出高修饰位点密度(图9B)。在XM-2020和GD中分别确定了43个和31个高置信度m5C位点;在“C”周围没有明显的motif(图9C)。3’剪接序列的起始处m5C频率显著增加,表明这种修饰富集在sg mRNA的翻译起始密码子周围。

 

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图9 PRRSV中m5C修饰的潜在特征

 

研究结论

 

本研究结合纳米孔长读长技术和下一代短读长测序方法来研究PRRSV全基因组全长剪接异构体,并准确地重建内部转录组结构。这种混合解决方案可以弥补各自技术的弱点,允许更准确地揭示转录组的复杂性, PRRSV的转录调控机制将有助于研究人员追踪并制定更好地抑制该病毒的策略。

 

参考文献

Riteng Zhang,et al. Nanopore-Based Direct RNA-Sequencing Reveals aHigh-Resolution Transcriptional Landscape of PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus. Viruses,2021

 

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