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合作文章 | cell子刊发表Nanopore Direct RNA测序揭示蜂王和工蜂发育过程中RNA 加工复杂性文章


近日,贝纳基因合作项目:蜜蜂Direct RNA测序研究成果以“Extent and complexity of RNA processing in honey bee queen and worker caste development”为题,在《Cell》子刊《iScience》期刊上发表。本项目由贝纳基因携手江西农业大学等多家单位共同合作完成。

 

文章概述

 

蜜蜂蜂王和工蜂来自于相同的受精卵,因幼虫期食物营养水平不同而分化为两种不同的表型。这一现象称为“级型分化”,是表观遗传学的典型模型。该研究采用Nanopore Direct RNA 测序(DRS)技术发现蜂王和工蜂在幼虫发育过程中存在十分复杂的RNA加工和修饰过程。该研究首次发现蜜蜂级型分化过程受到了更为精确的转录本表达差异调控,并证明这些差异的转录本来自于一个非常灵活多变且复杂的可变剪切加工系统。同时,该研究首次发现每条转录本的Poly(A)尾可以通过负调控转录本的表达来参与调控蜜蜂的级型分化。该研究不仅深入解析了蜜蜂级型分化过程中复杂的RNA加工和修饰,也为其它动物的表型可塑性研究以及其内在的分子调控机制提供了科学借鉴。

 

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主要结果

 

1. Direct RNA 测序数据质量

作者分别选取了2日龄、4日龄和6日龄的蜂王和工蜂幼虫样本,各2个生物学重复,使用 DRS分别对12个样品进行建库测序。每个样本的平均clean reads数为5,416,798(表1)。平均 N50长度为1296bp,平均reads质量为10.63(表1) ,表明测序RNA的完整性很高。平均98.13% 的clean reads比对到蜜蜂参考基因组(Amel HAv 3.1)。每组两个生物学重复的Pearson相关系数均在0.85以上,样本聚类树也显示每组两个重复聚集在一起,表明生物重复性良好。

 

表1 Direct RNA 测序数据概述

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2. 鉴定显著差异表达的isoform(DEIs)和基因(DEGs)

结果表明,在蜜蜂级型分化中存在着全基因组差异表达的isoform。和蜂王相比,在2d、4d 和6d的工蜂幼虫中,分别鉴定了662个、1855个和1042个 DEIs,数量明显高于 DEGs (分别为281个、1369个和645个,图1a)。为了比较 DEIs 和 DEGs 之间的差异,首先将 DEIs 比对到参考基因(DEIGs)上,发现在2d、4d 和6d 工蜂中,DEIGs 和 DEGs 之间分别只有271个(34.72%)、977个(53.45%)和410个(38.32%)重叠(图1b、 c 和 d)。表明,在蜂王和工蜂的分化上DEIs 和 DEGs有很大差异。

 

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图1 蜂王和工蜂幼虫的差异表达isoform和差异表达基因、Poly(A)长度的比较

 

分别在 2d、4d 和 6d 比较组中鉴定到 24、54、48 个DEIs参与蜜蜂级型分化的几个关键的KEGG 信号通路,如 mTOR,Notch,FoxO,Wnt,IIS,Hippo,TGF-beta  和 MAPK。这些信号通路在2d、4d 和 6d分别有7、34、33个 DEGs富集。在2d、4d 和6d 的比较组中, Poly(A)长度与isoform数量成负相关,蜂王较多(图1a) ,工蜂较少。

 

DEIs 和 DEGs 在5个关键的 KEGG 信号通路(mTOR,Notch,FoxO,Wnt,IIS)中富集,这些通路以前被证明参与了蜂王的分化。DEIs 存在于这5条通路中的35个蛋白质上,而DEGs存在于17个蛋白质上(图2a)。其中23个蛋白质仅存在于 DEIs,而有5个仅存在于DEGs,12个蛋白质同时存在于DEI 和 DEG 中(图2a)。以上结果表明,与DEG相比,这5个关键通路中显著差异表达了更多的isoform,每个 DEIG 的差异表达isoform如图2b 所示。

 

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图2 DEIs 和 DEGs 在5条 KEGG 通路中的表达和富集

 

3. 蜂王和工蜂之间特异性表达的isoform

作者分别在2日龄、4日龄和6日龄蜂王和工蜂幼虫中鉴定了187、357和364个特异性表达的isoform,其中蜂王比工蜂多(图3a)。蜂王特异性表达的isoform数量在第4天达到最大值,而工蜂在第6天达到最大值。这表明在幼虫早期,蜂王发育分化较快,而工蜂发育分化较晚。

 

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图3 蜂王和工蜂幼虫的特异性表达的isoform

 

特异性表达的isoform被富集到8个关键的 KEGG 信号通路,如 mTOR 和 IIS,以及一些关键基因,如 DNA甲基转移酶3(Dnmt3)和 Ecr (图3)。表明在蜂王或工蜂的发育过程中,存在特异性表达的isoform,这些isoform可能参与蜜蜂的级型分化。

 

4. DEIs 和可变剪接

在每个样本中平均鉴定出21,574个isoform,比对到平均8509个参考基因上(表1)。表明蜜蜂基因组中,基因会产生了不同的isoform。通过对可变剪接事件进行分析,发现绝大多数DEIs (2d、4d和6d的DEIs分别为73.26%、67.98%和63.53%)包含AS事件,其中绝大多数存在至少两种类型的AS。最常见的类型是 RI、A5和A3组合。表明在蜜蜂发育过程中转录本的形成比以前所知的更为复杂。

 

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图4 3个不同发育时间的可变剪接事件

 

通过对2d、4d 和6d的工蜂和蜂王的比较,发现9.82% (65)、5.71% (106)、9.50% (99)的DEIs存在显著差异AS 事件。其中有很多包含至少两种显著差异的AS事件。

 

5.  Poly(A)长度与 DEIs 和 DEGs 表达的相关性

通过对Poly(A)长度分析,发现isoform表达与其Poly(A)尾长呈负相关。DEIs和 DEGs的表达也与其 Poly(A)长度呈负相关,且这种负相关性在DEI中强于DEG(图5)。表明,Poly(A)尾通过负调控DEI,进而参与调控蜜蜂级型分化。

 

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图5 Poly(A)长度与 DEIs 和 DEGs 表达的相关性

 

6. 两个关键基因的isoform表达与Poly(A)长度的相关性

以参与蜂王分化的两个关键基因:Jhe 和 Ecr为例,展示isoform表达与Poly(A)长度之间的相关性。Jhe 只有一个isoform,与Poly(A)长度呈负相关(图6a)。Ecr 基因有4个isoform,选择最显著差异表达的isoform(Ecr.t4)来展示,同样,Ecr.t4 的表达也与其Poly(A)长度呈负相关(图6b)。通过对 Ecr 基因的两个isoform(Ecr.t1和 Ecr.t2)进行 TaqMan 实时定量 PCR 验证,结果与 DRS 结果基本一致,证实了在蜜蜂级型分化中存在偏向性的isoform表达。

 

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图6 2个关键基因的isoform表达与Poly(A)长度的相关性

 

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图7 TaqMan 实时荧光定量 PCR验证Ecr 基因的两个isoform表达情况

 

总结

 

总之,RNA加工在蜜蜂表型可塑性方面起着重要作用,该研究使用DRS技术,显示了蜂王和工蜂之间isoform表达的差异程度,转录本剪接的复杂性和Poly(A)长度的相关性。该研究不仅深入解析了蜜蜂级型分化过程中复杂的RNA加工和修饰,也为其它动物的表型可塑性研究以及其内在的分子调控机制提供了科学借鉴。

 

参考文献:

Xu Jiang He, et al., Extent and complexity of RNA processing in honey bee queen and worker caste development. iScience, 2022. https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.104301.

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