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慢性淋巴细胞白血病SF3B1基因突变的全长转录本特

 
SF3B1是剪切体U2-snRNP的核心成分,其复发性体细胞突变与多种疾病有关,包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)。使用Nanopore分别对CLL 分离的SF3B1野生型,突变株和正常组B细胞样本进行全长转录组测序,并开发了一套分析流程。检测到的3'末端剪接位点的差异,与以前的研究一致;还检测到突变株内含子显著性下调。全长转录组分析,可以将多个剪切事件关联,可以更好评估二代数据无法评估的编码异构体(编码蛋白)和非编码异构体(不编码蛋白)。该工作证明了Nanopore测序在癌症和可变剪切中的潜在使用价值。


研究背景

在癌症中,剪切因子的突变与RNA前体剪切改变有关。特别是,SF3B1的复发性体细胞突变与多种疾病有关,包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、葡萄膜黑色素瘤、乳腺癌和骨髓增生异常综合征。SF3B1是剪切体U2-snRNP的核心成分,与mRNA前体的U2-snRNA和分支点A相关。在CLL中,SF3B1的HEAT-repeat domain的突变,如K700E热点突变与不良的临床结果相关。
SF3B1造成的Atm缺失的小鼠模型中表达SF3B1基因可以导致低外显率的CLL,证明SF3B1突变在CLL的形成中起着驱动作用。此外,短序列测序的转录组测序证明,SF3B1的突变诱导了异常的剪切模式。突变株SF3B1已被证明能改变的3′末端剪切。对突变的SF3B1表达干扰,可以抑制肿瘤生长,进一步揭示了SF3B1的治疗意义。
使用短读长的转录组测序已经对SF3B1突变诱导的可变剪切(AS)模式进行了研究,但是并未在异构体层面进行分析。另外,短序列很难全面的反映外显子之间的链接,对内含子保留定量是非常困难的,往往在分析的时候被忽略。
 
 



材料和方法

CLL患者肿瘤样本中分离的3个野生型SF3B1(SF3B1WT),3个K700E突变(SF3B1K700E),以及3个正常组织分离的B细胞样本。分别对每个样品进行RNA提取,反转录成 cDNA后分别进行Nanopore PromethION(1D建库)测序和二代转录组测序,同时对每组样品进行一次Nanopore MinION(2D建库)测序。同时,作者开发了一套算法,对数据进行分析。


研究结果

数据产出统计


Nanopore测序共产生257 M 的reads,其中30.5%为全长序列。数据的长度和已有其他报道的数据相似,保存了5年的RNA没有显示出明显的降解迹象。MinION和PromethION基因表达Pearson相关性为0.82,因此数据可以进行后续分析。
作者开发了一个FLAIR的分析流程,对以前的分析方法进行优化,该方法可以提高剪接位点识别的准确性,同时具有更高的灵敏度和精确度。

3′末端剪切分析

以前使用Illumina的数据在37个CLL样本17(24个SF3B1WT和13个SF3B1突变)中鉴定到65个3′末端剪切发生了显著改变。使用Nanopore数据鉴定到的这些3′末端剪切的dPSI与二代的做比较,随着测序深度的增加,二者的dPSI越相似。Nanopore数据鉴定到35个备选3’可变剪接位点(其中2个位点以前有文献报道)和10个5’ 可变剪接位点。
 



作者在以前发现的65个3′可变剪接位点上游发现了一个13-16bp 连续的A序列,这与其他SF3B1突变研究结果一致。长序列不仅能够识别突变的SF3B1改变的剪接位点,而且还可以与其他mRNA前体的成熟过程中的异常关联。
 


差异内含子保留分析

内含子保留(IR)在肿瘤组织和正常组织中有着非常大的差异,不过短序列很难检测,特别在复杂AS57的区域。长序列可以跨越多个外显子和内含子,可以检测连续的多个AS(包括IR),更容易识别和量化IR。使用Nanopore数据分析发现,SF3B1K700E(突变株)中的IR异构体相对SF3B1WT(野生型)表达整体下调(其中70个差异显著,Illumina序列没有检测到),同时可以检测到IR同步的外显子跳跃的异构体。B细胞与SF3B1K700E的IR异构体的表达整体无明显变化。对以前CLL短读长数据的在进行分析证实了CLL-SF3B1WT观察到的IR, SF3B1K700E较SF3B1WT相对减少但是差异不显著。对已经发表乳腺癌样本(无常见剪切因子突变)与SF3B1K700E的数据再进行分析,也发现同样的趋势。
 



差异内含子保留的剪接位点分析

从CLL短读长识别出的IR中,作者发现在3′末端剪切位点上游15bp处有一个TGAC分支的Motif,在其他研究中也有报道,不过位置不完全相同;Nanopore数据未识别到剪接位点,可能是序列错误率较高造成。作者使用组装的转录本和异构体定量,鉴定到143个全长异构体,其中53个在野生型和突变株中存在显著差异(包含5个3′末端剪切位点,1个5′末端剪切位点,8个保留内含子和28个外显子跳跃),其中FLAIR识别出多个剪切类型。SF3B1K700E较SF3B1WT,基因LINC01089、LINC01480、XBP1内含子保留的异构体表达降低。这些IR异构体与3′末端剪切耦合,这种耦合很难用短读长检测到
 

编码和非编码内含子保留异构体分析

短读长研究发现CLL中的突变株预测与提前终止密码子(PTCs)增加有关。通过全长cDNA测序,能够更好地检测(而不是预测)PTCs转录本的比例。因此相对短序列,全长cDNA序列更容易识别编码和非编码异构体,作者的结果与已经报道的数据结果一致,同时可以发现5个新的异构体。并且大多数由局部变化预测的这种异构体与全长一致,只有少部分例外。同时检测到相对于野生型,突变株的非编码内含子保留异构体下调。


结论

基于Nanopore的全长cDNA测序可以检测转录本全长,通过算法优化,相对于短序列,可以更准确的检测3′末端剪切,内含子保留,分辨生产性异构体和非生产性异构体。该工作证明了Nanopore测序在癌症和可变剪切中的潜在使用价值。
 
参考文献
Tang AD. et al. Full-length transcript characterization of SF3B1 mutation in chronic lymphocytic leukemia reveals downregulation of retained introns. Nature Communications 2020;11(3) :1-12.
 
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