Isoform 定量全长转录组

超过90%人类基因通过可变剪切产生异构体（Isoform），平均每个基因产生3-6个Isoform（每种细胞类型表达最高的2个lsoform），其中60%的剪切变体会编码出不同的蛋白质异构体，二代转录组一般对基因进行定量（基于最长转录本进行GO、KEGG等分析），Isoform定量转录组可实现转录本的定量，对基因的每一个Isoform进行解析。

Isoform定量全长转录组和二代转录组建库和定量的比较示意图

注释：

二代转录组一般对基因进行定量，不能实现转录本准确定量，功能分析（GO、KEGG等）是基于最长转录本进行分析；Isoform定量转录组可实现不同Isoform的定量，对所有转录本进行功能分析。

Q：全长转录组测序的取样建议？

全长cDNA细胞总量≥ 1 X 107个起送，全长转录组植物组织送样量须达到至少0.5g，动物取新鲜组织，组织体积要小，尽量长宽高≤0.5cm ，所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小，送样量须达到至少0.2g。血液样本通常建议送新鲜血样，哺乳动物全血：2.5-5ml；鱼类、禽类、两栖类全血：0.5-1.0ml 及以上。

Total RNA的送样要求：

Q：全长转录组测序必须做生物学重复么？需要几个重复？

生物学重复是生物实验所必须的，全长转录组测序也不例外，至少3次生物学重复。生物学重复的设置需要考虑研究成本、样本采集难度、数据分析能力、预期研究水平等多方因素。

Q：全长转录组测序推荐的测序数据量？

全长转录组测序所需数据量与所研究物种的基因组大小有关，基因组越大，则所需数据量越大。一般来说：常规物种一般建议6G数据即可；基因组较大的物种推荐8G以上数据，人类样本建议10G数据起，甘蔗甘薯建议15G起，小麦建议20G起。

Q：如何判断差异基因在两个样品间的差异大小？

差异的显著情况可通过矫正后的pvalue来看，矫正后的pvalue越小，差异越显著。也可通过|log2Foldchange|来判断差异的大小情况，|log2Foldchange|越大，差异倍数越大。

Q：样品间的相关性有何意义？如何计算？

样品间的相关性反应了样品间的相似程度，即不同处理或组织的样品在表达水平方面的相似度。相关系数越接近1，样品间的相似度越高，样品间的差异基因也越少。生物学重复间的样品的相关系数应大于生物学重复外的样品的相关系数。相关系数的计算方法有三种：A.Pearson correlation；B.Spearman rank correlation；C.Kendall’sT。贝纳使用R语言进行Pearson 相关系数的计算。

案例一

项目案例 靶向 PTBP3 介导的 COX11 可变剪接诱导铜死亡抑制胃癌腹膜转移(Advanced Science,lF=14.1)

胃癌腹膜转移(GCPM)是晚期胃癌患者死亡的主要原因，其机制复杂且治疗手段有限。可变剪接(AS)失调在肿瘤进展中发挥重要作用，但针对胃癌腹膜转移相关剪接因子及事件的系统性研究仍较少。

本研究首次发现，剪接因子PTBP3在胃癌腹膜转移灶中特异性高表达，PTBP3通过调控线粒体铜转运蛋白COX11的可变剪接，产生截短型转录本(S-COX11)，导致线粒体铜稳态失衡，促使肿瘤细胞逃避铜死亡。靶向S-COX11的反义寡核苷酸(ASO)药物联合外源铜离子载体，可有效降解S-COX11，破坏铜稳态，诱导铜死亡，从而抑制GCPM。该研究不仅揭示了PTBP3-COX11可变剪接轴在GCPM中的核心作用，更为基于诱导铜死亡的新型联合治疗策略提供了重要的理论某础。

研究发现剪接因子PTBP3在胃癌腹膜转移灶中特异性高表达，与患者不良预后显著相关。通过类器官模型及细胞实验验证，PTBP3过表达可增强胃癌细胞侵袭与增殖能力，促进腹膜转移。通过ONT全长转录组测序发现，PTBP3作为剪接抑制因子，介导铜转运蛋白COX11外显子4跳跃，产生截短型S-COX11。S-COX11在转移灶中的比例显著升高，导致线粒体铜离子外排，稳态失衡，使肿瘤细胞逃避铜死亡。

研究设计了靶向S-COX11的ASO，可高效降解S-COX11 mRNA。在细胞及类器官模型中，ASO处理显著抑制PTBP3介导的肿瘤侵袭、增殖及3D肿瘤球体形成。进一步的机制研究表明，ASO通过恢复线粒体铜积累，联合铜离子载体Elesclomol-CuCl,可触发典型铜死亡。在患者来源类器官移植模型中，ASO单药或铜载体联合治疗，可诱导胃癌转移灶铜死亡，显著抑制肿瘤生长。

综上所述，本研究提出了PTBP3在GCPM中的分子机制:PTBP3 通过介导COX11 外显子4 跳跃产生 S-COX11，降低线粒体铜浓度以逃避铜死亡，最终促进胃癌腹膜转移的机制。并首次提出通过靶向剪接异构体S-COX11协同诱导铜死亡作为治疗腹膜转移的新策略。

参考文献

案例二

项目案例 Nanopore全长转录组揭示可变剪接调控植物光形态建成的分子机理（The Plant Cell，IF=12.085）
 

选择性剪接（AS）是一个关键的转录后过程，可调控基因转录翻译成不同的蛋白质变体，多用于蛋白质组多样性和基因调控研究。本研究发现拟南芥RNA解旋酶UAP56在体内外与光信号通路中的核心角色E3泛素连接酶COP1相互作用，并通过Nanopore全长转录组测序技术阐明UAP56和COP1共同调节许多基因的表达水平以及许多常见前信使RNA（mRNA）的剪接。


UAP56和COP1共同调节基因表达

为了研究UAP56和COP1如何共同调控光形态发生，对d3#2和cop1-4以及Col-0进行了Nanopore全长转录组测序分析。在黑暗和红光照射1小时后，与Col-0相比，在d3#2系中发现了也受COP1的调控基因。UAP56和COP1共同调节与光合作用及光应答相关的基因表达，以及黑暗或光明中的激素反应。

UAP56和COP1控制mRNA的选择性剪接

d3#2和cop1-4中的剪接模式在黑暗和光明中与Col-0相比有很大不同。414和503个AS事件分别在黑暗和红光照射中由UAP56与COP1共同控制。共调节AS事件的基因在uap56和cop1系中部分重叠。

UAP56和COP1调节光介导的AS

比较d3#2和cop1-4中受光-暗调节的AS事件，发现433和599 AS事件分别受到黑暗和光明中UAP56突变的特异性影响。d3#2和cop1-4背景中剪接效率的变化与Col-0有很大不同。

结论：
该研究一方面鉴定到光形态建成的新成员UAP56，另一方面发现了COP1作为可变剪接调节因子的新功能，揭示了UAP56与COP1共同通过调节下游基因可变剪接来调控光形态建成的分子机制和调控网络，增加了对植物光信号转导机制的认识。
 
参考文献：
Yang Li, et at. The RNA helicase UAP56 and the E3 ubiquitin ligase COP1 coordinately regulate alternative splicing to repress photomorphogenesis in Arabidopsis. The Plant Cell,2022

利用 gffcompare，将非冗余转录本与基因组的已知转录本进行比较，发现新的转录本和新基因，对现有注释进行补充，使用七个数据库进行转录本功能注释，包括：Nr、Pfam、Uniprot、KEGG、GO、KOG/COG、PATHWAY。

样品中新转录本类型的数量分布图、

对基因包含转录本的数目进行统计，基因包含转录本数目大于8个，统一记为一类，从已知和所有两个方面进行统计绘图。

包含不同数目转录本的基因数目图

基因转录生成的前体 mRNA（pre-mRNA），有多种剪接方式，选择不同的外显子，产生不同的成熟 mRNA，从而翻译为不同的蛋白质，构成生物性状的多样性。这种转录后的 mRNA 加工过程称为可变剪接或选择性剪接（Alternative splicing）。通过 suppa2软件获取每个样品存在的可变剪接类型，对转录本发生可变剪接事件情况进行统计。

可变剪接类型分布图

可变剪切的差异分析就是对可变剪切产生的 isofrom 进行定量，然后进行差异分析。使用 suppa2（DiffSplice） 鉴定组间差异可变剪切，差异可变剪切数量统计如下表。

表 差异可变剪切类型统计表

利用表达定量得到的转录本在各个样品中的表达量 reads count 数据，进行差异表达分析。差异表达分析的软件为 DESeq2 ，筛选阈值为 padj < 0.05 且 |log2FoldChange| > 1.0，鉴定的差异表达转录本数目。

差异表达转录本火山图

富集分析统计学方法一般使用超几何检验，找出差异基因/转录本相对于所有有注释的基因/转录本显著富集的 GO Term 或 KEGG Pathway，KEGG富集分析软件为 clusterProfiler，GO富集分析软件为topGO。

差异表达转录本 GO 富集分析 dotplot 图

差异表达转录本 PATHWAY 富集分析 barplot 图