花生（Arachis hypogaea L.）作为全球重要的油料作物和蛋白质来源，其独特的荚果发育过程一直是研究的热点。花生荚果发育的特殊性在于：子房柄在地上形成后，需要穿透土壤进入地下环境才能完成后续膨大与成熟。这一复杂过程涉及多种调控机制，包括转录调控和转录后调控。以往的研究多采用二代测序技术（NGS）关注转录层面的调控，而对转录后调控机制（如多聚腺苷化、选择性剪接和RNA甲基化修饰）在荚果发育中的作用了解甚少。

纳米孔直接RNA测序技术（DRS）的发展，使得同时检测RNA碱基修饰、多聚腺苷酸尾长度（PALs）和RNA剪接形式成为可能，为全面解析转录后调控机制提供了有力工具。近日，来自北京大学现代农业研究院的刘晓芹团队在aBIOTECH期刊（IF=5.0）上发表了题为Identification of the post-transcriptional regulation reveals complexity in peanut pod development by Direct RNA的研究论文，该研究利用Direct RNA测序技术，系统分析了花生荚果四个关键发育阶段的转录后调控动态，并揭示了这些机制在荚果发育中的复杂调控作用。

贝纳基因参与了该项目Direct RNA测序分析工作。

研究结果

1. 花生荚果的发育表型与转录本结构特征

研究通过对花生荚果四个关键发育阶段（地上子房柄AerPeg、入土未膨大SubPeg、初期膨大ExpPod1和幼果形成ExpPod2）进行DRS测序（图1A），获得了超过70M条长读长reads，平均长度890~1136nt，远远大于常规NGS的200nt读长。转录本覆盖度分析显示，全长reads在转录本上分布均匀（图1B）。与参考基因组注释相比，DRS检测到的转录本中<3000 bp的转录本显著更多（图1C）。

选择性剪接分析显示，AerPeg阶段的AS事件数量最多（图1D），其中外显子跳跃（ES，45.26%）和5'剪接位点变异（A5，16.36%）是主要类型（图1E）。进一步分析发现，具有选择性首尾外显子（AF/AL）型AS的转录本表达水平显著高于其他类型（图1F），推测这类AS事件可能与基因的高效表达相关。

图1：花生荚果的发育表型与转录本结构特征

2. 新转录本和基因的发现

研究共鉴定到14,627个新转录本，其中未知类型（U，7376个）和跨外显子连接类型（J，4533个）占主导（图2A）。这些新转录本对应6,769个新基因（图2B）。新转录本的CDS长度多数小于5000 bp之间，N50为2362 bp（图2C）。染色体分布分析表明，这些转录本均匀分布在染色体两端（图2D）。功能富集分析显示，这些新基因主要参与DNA内复制、自花花粉排斥、防御反应和生长素响应等过程。

图2：新转录本和基因的发现

3. 发育阶段特异的转录表达模式

主成分分析（PCA）显示，四个发育阶段的表达模式存在显著差异（图3A），其中AerPeg与ExpPod1阶段的差异最大（6,139个差异表达转录本），而ExpPod1与ExpPod2阶段的转录状态最为相似（仅400个差异表达转录本）（图3B）。差异表达基因主要富集在光合作用、氧化应激响应、生长素响应、植物型细胞壁组织和木质素分解代谢等通路（图3C），其中光合作用相关基因在AerPeg阶段表达最高；氧化应激响应基因在AerPeg和SubPeg阶段高表达；木质素代谢相关基因（如漆酶基因）在发育过程中显著下调；而扩张蛋白基因在整个发育过程中持续高表达。

图3：发育阶段特异的转录表达模式

4. APA位点使用的动态变化

分析APA位点使用的变化规律，结果显示在SubPeg与AerPeg比较中，转录本从远端APA位点（dPAS）向近端APA位点（pPAS）转换（图4A），这种趋势在ExpPod1与SubPeg比较中更加明显（图4B）。在整个荚果发育过程中，使用近端APA位点的基因数量逐渐增加（图4C）。RED评分分析显示，SubPeg与ExpPod2阶段的RED评分最低（-0.15），表明3' UTR整体缩短（图4D）。此外，差异APA基因主要富集在蛋白质折叠、mRNA剪接、细胞壁组织和果胶生物合成等过程，说明APA位点使用的转变与荚果发育过程中的细胞分化、细胞壁重构和代谢调节等关键过程密切相关。

图4：APA位点使用的动态变化

5. 多聚腺苷酸尾长动态变化

PAL分析显示，AerPeg阶段的中位PAL为84.38 nt，SubPeg和ExpPod1阶段显著缩短（分别为79.91 nt和81.6 nt），而ExpPod2阶段则延长至86.59 nt（图5A）。全长reads的PAL显著短于非全长reads（图5B）。比较分析发现不同发育阶段间有数百个转录本的PAL显著变化（图5C）。例如，木葡聚糖代谢基因AhXTH5的PAL随发育逐渐延长（图5D），但其表达水平却下调（图5E），证实PAL与表达呈负相关。此外，AF/AL型AS转录本的PAL显著短于其他类型（图5F）。

图5：多聚腺苷酸尾长动态变化

6. m6A修饰分析

研究共鉴定到35,704~36,458个m6A位点（图6A），这些位点主要富集在终止密码子附近和3' UTR区域，符合典型的m6A修饰分布特征（图6B）。m6A修饰率在AerPeg阶段略低（49%），其他阶段均为50%，说明m6A修饰在荚果发育过程中保持相对稳定（图6C）。大部分m6A修饰位于CDS区域（74-75%），其次是3' UTR（20-21%）和5' UTR（5%）（图6D）。差异表达分析发现53~69个基因同时具有m6A修饰水平和表达量的变化（图6E）。近端APA富集区域的m6A修饰率显著低于远端APA区域（图6F）。同时，m6A修饰转录本的PAL显著短于未修饰转录本，表明m6A修饰可能通过影响多聚腺苷酸化来调控转录本稳定性。（图6G）。此外，m6A相关酶基因（如AhFIONA1、AhALKBH10Bb）呈现明显的阶段特异性表达模式（图6H），推测这种阶段特异性的表达模式可能与m6A修饰在荚果发育过程的精确调控有关。

图6：m6A修饰分析

研究结论

本研究通过DRS技术首次全面揭示了花生荚果发育中复杂的转录后调控网络，发现了大量新转录本和基因，揭示了APA位点使用从远端向近端的动态转换，明确了PAL与基因表达的负相关关系，并解析了m6A修饰的阶段特异性调控模式。这些发现为深入理解表观遗传和转录后调控在荚果发育中的作用提供了重要理论基础，对提高花生产量和品质具有重要指导意义。同时研究还证实了DRS技术在植物转录组学研究中的强大能力，为后续功能研究提供了丰富资源。

参考文献：

Wang W, Guo H, Bian J, et al. Identification of post-transcriptional regulation reveals complexity in peanut pod development by Direct RNA[J]. aBIOTECH, 2025: 1-15.

Direct RNA测序——RNA Modified Bank

Direct RNA Sequencing（DRS）是指基于 Nanopore 测序平台，不经反转、无需扩增，直接读取含有Poly(A)尾的全长RNA（而不是cDNA），可以检测 RNA 分子上的 m6A、m5C、假尿苷、肌苷和2-O-甲基化等修饰位点，准确分析可变剪接、融合基因和鉴定新异构体；此外，还可对 Poly(A) 尾长进行相对准确的估算，还原真实 RNA 特征，并且实现转录本的表达水平准确定量。

技术优势

1、单碱基水平RNA 修饰（m6A、m5C、假尿苷、肌苷和2-O-甲基化等）

2、单分子read 的poly(A)长度

3、准确率大幅提升（reads质量中位值达Q20，m6A的识别准确率98.7%，假尿苷Ψ (97.6%)，m5C (97.9%)，肌苷 (inosine, 98.8%) ，2-O-甲基化（96%以上））

贝纳基因现已完成3000+样本的Direct RNA测序服务，覆盖人细胞和肿瘤，动植物组织和细胞、真菌、病毒等各种类型的样品，并发表多篇高水平文章。