提到原核生物（细菌和古菌），你脑海里是否会浮现 “结构简单” 的固有印象？长期以来，原核转录组的转录过程被简化为：以操纵子为基本单位的协同表达模型，即多个功能相关基因由同一启动子起始转录，并在共同终止子处结束，产生单一的多顺反子转录本。

然而，2024 年 9 月发表于《mBio》期刊的研究论文《Deciphering transcript architectural complexity in bacteria and archaea》，借助牛津纳米孔技术（ONT）的直接 RNA 测序（DRS）技术，系统揭示了原核生物转录本在结构、加工及调控层面具有前所未有的复杂性，显著修正了这一传统认知。

一、转录本定义的革新：从操纵子产物到独立分子实体

既往研究常将DNA层面的操纵子结构与RNA层面的转录本混为一谈，并过度聚焦于蛋白质编码序列，忽视了非编码RNA的重要贡献。本研究基于细菌DRS（图2）数据，明确提出：转录本是由DNA模板转录而成、具有明确5′端起始和3′端终止位点的物理RNA分子，其边界受到启动子、终止子及转录后加工共同调控（图1）。

图 1 所用转录本、操纵子及非翻译区（UTR）的定义概述

图 2 实验/分析工作流程概述

这一重新定义带来了三大突破：

首先，区分了操纵子和转录本。操纵子作为遗传层面的静态单元，可通过可变启动子、终止子及RNA加工机制产生多个转录本。例如，致病性大肠杆菌E2348/69的LEE4毒力岛操纵子可经RNase E切割初级转录本，生成具有不同稳定性和功能的成熟转录本（如espADB和sepL），并存在终止子通读现象（图5）。

图 5 LEE4 操纵子转录本分析

其次，拓展了非编码 RNA 的范围。除了我们熟悉的 rRNA、tRNA，还有很多与毒力、应激调控相关的小 RNA。例如，在大肠杆菌K12中预测到1131个非编码RNA，占转录本总数的31.2%，其中多数与毒力调控、环境应激响应等关键生物学过程相关（表1）。

表 1 大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌及铜绿假单胞菌的预测转录本特征

最后，发现了转录本异构体的多样性。同一基因组区域能产生长度、起始/终止位点不同的多个转录本。例如，大肠杆菌的 fdoGHI/fdhE 区域，共预测出 11 个转录本异构体，既有只含一个基因的，也有含多个基因的，还有和其他转录本重叠的小 RNA，在LB与DMEM培养基中的表达谱显著差异，体现出环境依赖的转录调控灵活性（图4）。

图 4 fdoGHI-fdhE 区域转录本分析

二、原核转录本结构的多样性与复杂性

细菌DRS技术揭示了原核转录本在多个维度上的结构多样性：

转录本长度分布极广，从数十bp的调控小RNA（如大肠杆菌中89 bp的ncRNA）至超过29 kb的多顺反子mRNA（如单核细胞增生李斯特菌中编码噬菌体蛋白的转录本）（表1）。

单顺反子转录本占比较高。与传统认知不同，大肠杆菌K12中超过60%的mRNA为单顺反子，推测来源于多顺反转录本的加工产物（图3A, B）。

图 3 转录本预测结果的特征分析

非翻译区（UTR）表现出动态调控特征。所有受检菌株的 5'-UTR 和 3'-UTR 中位数在 30-90bp，但古菌Haloferax volcanii的 5'-UTR 中位数达 207bp，提示其可能具有独特的转录或翻译调控机制（表1）。进一步研究发现，UTR长度具有环境响应性。例如，在大肠杆菌K12中，fdoGHI/fdhE基因座在不同培养基（LB与DMEM）中表达不同的转录本异构体，其相应的UTR长度也发生显著变化，体现了UTR在转录调控中的条件依赖性灵活性（图4）。

此外，研究还观察到多种类型的重叠转录结构。同一基因组区域可同时发生正义链与反义链转录，所产生的反义RNA可能通过碱基配对机制参与mRNA的转录后调控。同一操纵子内也存在多个启动子或终止子的可变使用，如大肠杆菌thr操纵子可分别产生thrLABC和thrBC两种转录本，其在不同的培养条件下表达水平存在显著差异，该结果通过测序reads的覆盖分布得以验证（图2）。更有转录本跨越传统操纵子边界，将不同功能基因整合于同一转录单元，暗示其在协同调控中可能发挥重要作用。

三、技术推动认知：直接RNA测序与专用算法的作用

早期研究用的是为真核生物设计的工具，比如 StringTie、Rockhopper，分析原核数据时问题重重。短读长无法覆盖多个基因，难以确定转录本的真实边界，还忽略了原核生物高编码密度、转录翻译偶联等特点。

而 ONT 直接 RNA 测序和专门为原核生物开发的tp.py算法的组合，解决了这些难题。ONT 直接RNA测序技术，无需逆转录或PCR扩增，可直接获取RNA分子的完整序列及修饰信息（图2G-K）。tp.py 算法则先识别连续转录区域，再精准定位转录本边界，还会考虑 ONT 测序对短转录本的偏好和长转录本的截短问题，即便没有完整的长reads，也能可靠预测出 12kb 以上的长转录本。而且，这个算法效率高，参数经过优化后，可适用于多种原核生物（表1）。

四、转录本复杂性研究的生物学与临床应用价值

原核转录本结构的复杂性具有重要理论与应用意义：

在基因表达调控上，转录本能精细控制毒力表达，例如大肠杆菌 E2348/69 的 LEE4 操纵子，通过不同转录本的组合调控毒力；还能帮助细菌快速切换代谢通路，适应不同环境。

在医疗领域，关键的调控小 RNA，例如调控 LEE 操纵子的 glmY 和 glmZ，能作为 RNA 靶向药物的理想靶点；菌株特有的转录本，如毒力岛编码的小 RNA，可用于开发快速诊断试剂；此外，基于转录本和基于CDS的差异表达分析结果存在显著差异，揭示转录水平调控可能在抗生素耐药性形成中起到重要作用（图6I）。

图 6 预测转录本的差异表达分析

五、当前挑战与未来方向

目前原核转录本研究还面临以下瓶颈：大多数原核生物的转录本注释仍是空白，现有预测也需要更多实验验证；大量新发现的非编码 RNA 和转录本异构体功能还不清楚，也缺乏高效的研究工具；长读长测序在RNA完整性、长转录本捕获效率方面存在技术局限。

未来研究需整合多组学数据，构建更完整的调控网络；开发 CRISPR-Cas13 等新工具，研究特定转录本的功能；并建立统一的注释标准，更新现有基因组数据库，最终推动转录本结构注释成为原核基因组分析的必要组成部分。

结语

本研究通过创新测序技术与算法，揭示了原核生物转录组具有可与真核生物媲美的复杂结构及调控机制。这不仅深化了对原核生物基因表达调控的理解，也为抗感染药物研发及临床诊断提供了新的分子靶点与思路。

参考文献

Mattick JSA, Bromley RE, Watson KJ, Adkins RS, Holt CI, Lebov JF, Sparklin BC, Tyson TS, Rasko DA, Dunning Hotopp JC. 2024. Deciphering transcript architectural complexity in bacteria and archaea. mBio 15:e02359-24.

贝纳基因独家细菌DRS技术

细菌DRS技术能够直接读取完整的天然RNA分子，无需逆转录或PCR扩增，同步实现多种RNA类型的检测，并直接鉴定m6A、m5C、假尿苷、肌苷和2-O-甲基化等多种RNA修饰位点。该技术还能精准解析转录本及操纵子结构，最终呈现出一幅前所未有的、完整且动态的细菌转录组“全景图”。

技术优势

1. 获取全长转录本结构，避免拼接偏差

2. 直接检测多种RNA修饰，无需抗体或酶学处理

3. 解析操纵子精细结构，揭示复杂调控网络

4. 同时分析多类型RNA，一站式解析全转录组