苹果是温带地区种植最广泛、经济价值最高的果树作物之一，其果皮和果肉的红色是影响消费者偏好和市场竞争力的重要因素。尽管已有许多关于苹果果实中花青素积累的研究，但果皮和果肉着色发育的代谢途径和潜在机制尚未被阐明。海棠品种“Royalty”的果皮和果肉呈紫红色，从坐果开始到成熟，颜色覆盖整个果实，是研究果实着色的理想材料。

2025年11月3日，北京农学院植物科学技术学院田佶教授团队在国际著名学术期刊Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Genome Assembly Revealed MdZAT5 Coordinates Anthocyanin Biosynthesis in Apple Fruit Peel and Flesh by Interacting With MdHY5”的研究论文。该研究以红皮红肉海棠品种“Royalty”为研究材料，完成了其单倍型基因组组装，并结合转录组的分析结果，揭示了苹果果实花青素生物合成的潜在调控机制。

1. 染色体水平基因组组装和基因注释

本研究采用PacBio（71.17Gb，101.89x）和Hi-C（173.84Gb，248.88x）测序技术对海棠品种“Royalty”进行基因组的测序组装，组装的基因组大小为675.82Mb，共17条染色体，scaffold N50为36.53Mb，QV值为47.68，BUSCO完整度为98.9%。在组装的基因组中共鉴定到46507个蛋白编码基因，其中94.8%在功能数据库中有注释信息。

图1 海棠品种“Royalty”高质量基因组组装结果

2. 单倍型基因组组装和注释

K-mer分析预估“Royalty”基因组的杂合度为1.36%，表明该物种为高杂合的二倍体。所以该研究进一步通过Hifiasm软件对“Royalty”进行单倍型基因组组装，同时通过ALLHIC软件对Hi-C数据进行聚类、排序和定向，最终组装得到的两个单倍型hap1和hap2大小分别为666.85Mb和652.41Mb，两个单倍型均含有17条染色体，scaffold N50分别为36.53Mb（Hap1）和36.98Mb（Hap2），BUSCO完整度为98.7%（Hap1）和99.0%（Hap2）。共线性分析鉴定到两个单倍型之间存在293个共线性区块和176042个结构变异（SVs）。Hap1和Hap2中分别注释到45696和44622个蛋白编码基因。

图2 “Royalty”单倍型解析基因组

表1 两个单倍型的组装和注释数据

3. MdZAT5是潜在的花青素调节因子

本研究对“Royalty”果实不同发育阶段的果皮和果肉进行了转录组测序分析，在不同发育阶段的果皮中均检测到差异表达基因（DEGs）。“Royalty”果实发育的整个阶段，果皮和果肉中均检测到花青素，其中花青素-3-O-葡萄糖苷是最主要的成分，含量随果实发育而增加。WGCNA的分析结果表明，“Royalty”果皮和果肉中分别有18和15个基因模块与花青素含量相关，其中果皮的“MEgrey60”模块和果肉的“Meturquoise”模块和花青素积累相关性显著，MdZAT5 (MD03G1128800)是两个模块共有的枢纽基因。MdZAT5位于3号染色体和11号染色体，在hap1和hap2上均有2个拷贝，果实成熟阶段，该基因的4个拷贝都呈现高表达。

图3 果实花青素合成WGCNA分析

4. MdZAT5表征

研究发现，4个MdZAT5拷贝上游启动子2000bp的区域存在多个顺式作用元件，包括光响应元件（如G-boxes, GT1 motifs和GATA motifs），激素响应元件（如生长素响应元件TGA元件）和MeJA响应元件（TGACG-motif和CGTCA-motif），表明MdZAT5的转录可能受到光，生长素和MeJA的调控。用光照和MeJA处理苹果愈伤组织，MdZAT5-3G表达上调，MdZAT5-11G表达不受影响，体外启动子克隆和表达验证实验结果表明，光照和MeJA处理可以诱导MdZAT5-3G启动子活性增加，但是对MdZAT5-11G启动子活性没有影响。

图4 MdZAT5对光照和MeJA处理的诱导响应

5. MdZAT5通过转录激活花青素生物合成基因促进果实着色

本研究发现，在苹果果实中瞬时过表达MdZAT5-3G可以显著促进果实中花青素的积累，过表达MdZAT5-11G则对花青素积累无显著影响，抑制MdZAT5表达可以引起花青素含量下降。花青素合成基因MdCHS, MdCHI和MdF3H在果实中的表达水平变化趋势和MdZAT5-3G一致。在苹果愈伤组织中转入MdZAT5过表达（OE）和反义抑制（RNAi）载体后，OE-MdZAT5-3G愈伤组织表现出明显的花青素积累，且MdZAT5-3G转录水平和花青素合成基因（MdCHS, MdCHI和MdF3H）表达水平上调，OE-MdZAT5-11G愈伤组织无明显变化，RNAi-MdZAT5愈伤组织中MdZAT5-3G转录水平下调，花青素合成基因表达下降。因此，MdZAT5-3G通过激活花青素生物合成基因发挥花青素积累的正调控作用，而MdZAT5-11G不参与果实着色。

图5 MdZAT5表达在苹果果实和愈伤组织中的调控作用

体外酵母单杂交实验和荧光素酶报告实验的结果表明，MdZAT5-3G直接与花青素合成基因MdCHS，MdCHI和MdF3H的启动子结合，激活花青素合成基因转录。烟草叶片体内瞬时转化实验证实，MdZAT5-3G确实可以激活MdCHS，MdCHI和MdF3H基因的转录。

图6 MdZAT5蛋白对花青素合成基因的调控

6. MdZAT5和MdHY5蛋白间的相互作用

转录组分析结果表明，苹果果实发育过程中，MdHY5，MdCOP1和MdMYC2与MdZAT5-3G基因表达水平变化趋势一致，因此MdZAT5-3G和这些转录因子（MdHY5，MdCOP1和MdMYC2）之间可能存在相互作用。酵母双杂交实验以及体外pull-down实验的结果证实，MdZAT5-3G与MdHY5之间存在体外直接相互作用，体内荧光素酶互补成像实验结果证实，MdZAT5-3G和MdHY5在体内也存在相互作用。MdZAT5-3G可能通过与MdHY5结合协同调控光照和MejA处理下苹果果皮和果肉中花青素的积累。

图7 MdZAT5和MdHY5蛋白间的相互作用

7. MdHY5促进MdZAT5与靶基因的结合

该研究进一步发现，在MdZAT5-3G过表达的苹果果实中过表达MdHY5基因可以进一步促进花青素的积累，花青素合成基因MdCHS，MdCHI和MdF3H的表达水平也显著增加；抑制MdHY5基因表达，则花青素积累减少，花青素合成基因的表达水平也下降。MdHY5和MdZAT5-3G的结合显著提升了MdZAT5-3G与花青素合成基因启动子的结合能力，从而增加了花青素合成基因的转录活性。

图8 MdHY5促进MdZAT5对靶基因的调控

8. MdZAT5不同拷贝的结构差异

基于上述研究结果，MdZAT5-3G可以和MdHY5协同作用促进花青素的积累，但是MdZAT5-11G没有这个功能。因此，本研究进一步对MdZAT5-3G和MdZAT5-11G的三维结构进行了分析，结果显示MdZAT5-11G和dZAT5-3G的蛋白结合口袋分布显著不同，这可能导致MdZAT5不同拷贝的相互作用特征差异，从而影响了其特定的调控功能。

图9 MdZAT5-3G和MdZAT5-11G的三维结构预测

小结

该研究通过整合基因组学、转录组学、分子生物学以及生化实验的数据，系统阐明了苹果果实着色的分子调控机制，不仅完善了苹果花青素合成的转录调控网络，也为培育高花青素含量的苹果新品种提供了理论依据与基因资源。

参考文献

Zhao M, Zhang M, Sun W, et al. Genome Assembly Revealed MdZAT5 Coordinates Anthocyanin Biosynthesis in Apple Fruit Peel and Flesh by Interacting With MdHY5[J]. Plant Biotechnology Journal, 2025.

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