抗生素抗性基因（ARGs）分析

样品中有哪些ARGs？

ARGs丰度情况如何？

ARGs来自哪些菌种？

哪些可移动元件上携带有ARGs？

ARG分布于哪些位置？染色体还是质粒？

不同处理、不同背景下ARGs存在哪些差异？

抗生素抗性基因（ARGs）是一种新型、持久性的环境污染物，细菌中携带ARGs的质粒、整合子以及转座子等可在菌株间发生水平基因转移，菌株死亡后携带ARGs的DNA在环境中长期存在。^[1]本分析使用Nanopore测序技术得到DNA完整序列，通过生物信息分析研究环境微生物中ARGs的分布及其序列，从而可进一步挖掘其功能及机制。





经过分析可得

目标样本中ARGs鉴定结果

各样本ARGs丰度

抗生素抗性基因簇

ARGs所注释到的物种信息

ARGs所在位置

[1]Knapp C W , Engemann C A , Hanson M L , et al. Indirect Evidence of Transposon-Mediated Selection of Antibiotic Resistance Genes in Aquatic Systems at Low-Level Oxytetracycline Exposures[J]. Environmental ence & Technology, 2008, 42(14):5348-5353.

结果图展示

ARGs位置区分点图
注：横坐标为样本名称；竖坐标为ARG；不同的颜色代表不同的Type;最上层为位于质粒的ARG；中间层为位于ICE上的ARG；最下层是位于在染色体上的ARG。




不同位置注释到ARGs数目饼状图


ARG Type丰度堆积图
注：横坐标代表不同样本；竖坐标代表丰度占百分比；不同的颜色代表不同的ARG Type。



分类sankey图

注：横坐标表示不同层级；不同的颜色代表不同的物种；数字代表注释到的Reads数。

文献推荐：

Lou EG, et al. Sensitivity and consistency of long- and short-read metagenomics and epicPCR for the detection of antibiotic resistance genes and their bacterial hosts in wastewater. Journal of Hazardous Materials. 2024.

Q：什么是ARG（抗生素抗性基因）？常见的有哪些？

抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes）是指细菌对抗生素作用产生的耐受性基因，通过病毒、细菌等水平可移动层面广为传播，造成基因污染与食品安全问题，是目前最为关注的环境污染问题之一。

环境中常见ARGs的种类：四环类抗性基因（tetA，tetB，tetD，tetE，tetG，tetM，tetO，tetQ，tetS，tetW，tetX等）、磺胺类抗性基因（sul1，sul2，sul3等）、大环内酯类抗性基因（ermA，ermF，ermB，msrA，mef，mefA，mefE等）、喹诺酮类抗性基因（qnrB，qnrS，acc(6’)-Ib-cr等）、β-内酰胺类抗性基因（TEM，SHV等）。

Q：为什么要做ARG的分析？意义是什么？

世界范围内抗生素消费量不断增长，随之而来的抗生素耐药性问题及相关环境问题也变得日益严峻。抗生素的滥用导致其功效降低，每年抗生素耐药性导致数十万人死亡，长此以往，人类将会落到无药可用的境地（“超级细菌”就是最好的例证），对全球人类健康构成了极大的威胁。

环境中的致病菌、甚至人畜共患的病原菌也可通过基因转移获得一种或多重耐药性，并逐步扩散和繁殖，对人类和动物体疾病治疗已经构成了极大的挑战。

近几年世卫组织、各个国家接连出台了相关政策，以减轻抗生素滥用的情况，但是研究发现即便是控制了抗生素的使用，耐药性问题依然存在，并且愈演愈烈。

因此，有必要展开环境中ARGs的研究，从基因水平上解析细菌产生耐药性以及耐药性传播的分子机制，以便从根源上解决或减轻耐药性问题。

Q：ARG分析可以应用于哪些研究？

是污水处理厂、河口、湖泊、河流-水库系统、沉积物及农作物组织等各种环境中都普遍存在丰富ARGs。其中水体是环境中抗生素和ARGs最重要的归宿地之一。

Q：测多少数据量合适？

建议6G，如果样本中宿主占比明显、微生物组成复杂或是抗生素抗性不明显，建议加大数据量。

Q：基于Nanopore平台的ARG分析产品与宏基因组分析的关系？

基于Nanopore平台的ARG分析产品与宏基因组分析在样本的收集、DNA提取、文库构建、测序环节是一致的，区别在对测序数据进行了不同的生信分析。

ONT宏基因组测序揭示了污水处理厂中的移动抗生素抗药性

英文标题：Mobile antibiotic resistome in wastewater treatment plants revealed by Nanopore metagenomic sequencing

中文标题：ONT宏基因组测序揭示了污水处理厂中的移动抗生素抗药性

发表杂志：Microbiome

影响因子：11.607

发表年份：2019

技术路线：

结果：

该研究充分利用了Nanopore测序长读长、实时测序的优势，结合Illumina测序，开发了一套基于高通量测序的抗性基因遗传背景解析、宿主鉴定的分析流程。Nanopore极大地促进了多重耐药性结合质粒的研究，分析流程不仅使我们对污水处理体系可移动抗性基因组有了全新的见解，同时为进一步解析耐药菌株的产生以及传播机制提供了重要参考。

1. 携带抗性基因的质粒和整合性结合元件在污水处理体系的抗性基因组中占主导地位

2. 通过移动原件和宿主追踪识别广谱可持续抗性基因

3. 快速鉴定污水处理体系潜在耐药致病菌群

4. 基因型表型关联分析揭示质粒对于多重耐药菌株的重要贡献

5. 质粒携带的多重耐药基因簇

抗性基因(ARG：antibiotic-resistantgene)鉴定是基于reads使用last软件比对到贝纳自建ARG数据库（贝纳自建ARG数据库由ARDB、BARRGD、MicroBIGG-E、CBMAR、b-lactamase、MEGARes2.0、Mustard、FARME DB、NCBI AMRFinderPlus、ARG-ANNOT、SRST2、card、resfinder、vfdb等数据库整合去冗余构建而成）鉴定的。

对各样本注释到的ARG reads进行长度统计绘图：

图  reads长度分布图

表 各样本ARG鉴定统计结果

使用R包绘制抗性基因大类丰度的堆积图：

图  ARG Type丰度堆积图

基于kraken2物种分类做图展示：

图  sankey桑基图

质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力。会出现水平基因转移(HGT：horizontal gene transfer)现象。使用plasflow对ARG reads进行质粒与染色体区分，并对结果进行统计绘图：

图  各样本ARG Reads位置分布图