基于Nanopore平台测序的TAIL Iso-seq可以准确量化转录本的Poly(A)尾长度，同时分析可变剪接、融合基因、鉴定新异构体，精确定量转录本表达水平，深度解析Poly(A)尾在基因表达调控中的作用。

Q：Tail Iso-seq的取样建议？

Tail Iso-seq细胞总量≥ 1 X 107个起送，全长转录组植物组织送样量须达到至少0.5g，动物取新鲜组织，组织体积要小，尽量长宽高≤0.5cm ，所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小，送样量须达到至少0.2g。血液样本通常建议送新鲜血样，哺乳动物全血：2.5-5ml；鱼类、禽类、两栖类全血：0.5-1.0ml 及以上。

Total RNA的送样要求：

Q：Tail Iso-seq能测到lncRNA的Poly(A)长度吗？

可以，如果lncRNA有Poly(A)尾，可以通过Tail Iso-seq技术进行Poly(A)尾长度检测。

Q：Tail Iso-seq能检测近远端Poly(A)位点使用吗？

可以通过Tail Iso-seq技术直接分析基因Poly(A)位点的近远端usage情况。

Q：想了解某个基因的Poly(A)长度在组间差异及其与基因表达量的关系，怎么做？

Tail Iso-seq能够检测转录本在各样本中的Poly(A)长度分析，因此可以分析组与组之间Poly(A)长度差异。进一步将Poly(A)长度与转录本的表达量进行关联分析即可以得到Poly(A)长度与转录本表达的调控关系。

项目案例 Tail Iso-seq技术揭示TENT5A稳定MYC mRNA促骨肉瘤干性机制（Cancer Research，IF=16.6）

本研究基于骨肉瘤临床队列和单细胞转录组数据，发现非经典胞质多聚腺苷酸化酶TENT5A在MYC激活的肿瘤中显著上调，并与患者不良预后及化疗耐药密切相关。通过体内外功能实验，证实TENT5A以MYC依赖的方式驱动肿瘤干性维持、增强成瘤能力及转移负荷。

使用Tail Iso-seq技术，突破了传统RNA-seq无法直接测量Poly(A)尾长度的局限，在转录本异构体水平上实现了对Poly(A)尾动态变化的精准解析。测序结果显示：在MYC激活的骨肉瘤组织中，MYC mRNA的Poly(A)尾长度显著长于MYC未激活组；细胞模型中，TENT5A过表达可特异性延长MYC mRNA的Poly(A)尾，而敲低则导致尾长缩短；结合放线菌素D处理实验，Tail Iso-seq直接证实了Poly(A)尾延长与MYC mRNA稳定性增强之间的因果关系。此外，小分子抑制剂Ro-3306处理后，Tail Iso-seq分析进一步揭示，有652个基因同时出现Poly(A)尾缩短和表达下调，其中MYC靶基因集呈现最强负富集，明确了Ro-3306通过靶向TENT5A-MYC轴发挥药效。

本研究首次阐明了TENT5A介导的胞质多聚腺苷酸化是MYC转录后稳定的核心分子机制，解释了MYC拷贝数与表达水平脱节的临床现象。Tail Iso-seq技术直接证明了Poly(A)尾延长是MYC mRNA稳定的功能基础，为靶向“难以成药”的MYC蛋白提供了以TENT5A为节点的间接干预策略。

参考文献：

Tao Y, Zhang Q, Wang H, et al. TENT5A Maintains MYC mRNA Stability to Enhance Osteosarcoma Stemness. Cancer Research. 2026

项目案例 TAIL Iso-seq技术助力解析马铃薯盐胁迫下APA动态响应机制（Horticultural Plant Journal，IF=6.2）

1.  本研究通过多维度评价体系成功筛选出耐盐与盐敏感马铃薯种质，明确了耐盐型种质通过增强ROS清除能力、维持离子平衡及优化叶片结构适应盐胁迫的生理机制。

2. 使用TAIL Iso-seq技术，克服了传统RNA-seq在捕捉完整转录本及Poly(A)位点信息上的局限，首次系统揭示了马铃薯盐胁迫下全基因组APA动态图谱。研究发现大多数马铃薯基因具有多个Poly(A)位点，盐胁迫下耐盐与敏感材料的APA分布模式显著相反；盐胁迫普遍诱导3’UTR延长，且APA响应基因在耐盐材料中富集于离子转运和ROS清除等关键通路。

3. 揭示了APA调控盐胁迫响应的分子机制：耐盐马铃薯通过增加远端Poly(A)位点的使用，促使抗氧化等关键基因的3’UTR延长并上调其表达，从而应对盐胁迫。

参考文献：

Wang K, et al. Screening of salt-tolerant potato germplasms and dynamic changes of APA in response to salt stress. Horticultural Plant Journal, 2025

大多数真核 mRNA 的 3‘非翻译区域下游含有一个非模板化的 poly(A)尾，这个尾有助于 mRNA 的稳定和向细胞质内的运输。poly(A)尾长度会影响mRNA的翻译效率，因此，poly(A) 尾长度分析可解析 mRNA 降解和翻译的动态调控过程，也能够发现一些 RNA 裂解和加尾的未知特点。使用 Dorado对有效数据的 poly(A) 长度进行计算，获得转录本对应的 poly(A) 长度。

不同样本的 poly(A) 尾长的分布图

将 poly(A) 长度中位数与表达量关联起来，得到 poly(A) 长度与转录本表达量的关联结果。

样品 poly(A) 长度与表达量的分布图

在真核生物中50% ~ 80%的基因有多个poly(A)位点，这些基因通过选择不同poly(A)位点进行多聚腺苷酸化，进而形成多个不同的 mRNA异构体，这个现象称为可变多聚腺苷酸化(alternative poly(A)denylation, APA)。当APA发生在内含子区域或编码区时，不同poly(A)位点的使用可能会导致其编码的蛋白序列发生改变；当APA发生在基因的3’UTR区域，会产生不同3’UTR长度的mRNA异构体，而不同长度的3’UTR会影响RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)在mRNA 3’UTR区域的结合，进而影响mRNA的功能、稳定性、翻译以及亚细胞定位。

使用 Quantifypoly(A) 进行poly(A)位点的鉴定、聚类与注释。

PAT在基因各个区域分布图

基因的poly(A)位点数量分布如下图所示：

PAC数量分布图

3’UTR 长度变化统计如下图所示：

3’UTR长度变化的统计

3’UTR长度的变化与基因表达之间的关系结果展示如下：

3’UTR长度的变化与基因表达之间的关系

利用表达定量得到的转录本在各个样品中的表达量 reads count 数据，进行差异表达分析。差异表达分析的软件为 DESeq2 ，筛选阈值为 padj < 0.05 且 |log2FoldChange| > 1.0，鉴定的差异表达转录本数目。

差异表达转录本火山图

富集分析统计学方法一般使用超几何检验，找出差异基因/转录本相对于所有有注释的基因/转录本显著富集的 GO Term 或 KEGG Pathway，KEGG富集分析软件为 clusterProfiler，GO富集分析软件为topGO。

差异表达转录本 GO 富集分析 dotplot 图

差异表达转录本 PATHWAY 富集分析 barplot 图