LncRNA（Long non-coding RNAs）是一类长度大于200nt但不编码蛋白质，广泛存在于动植物中，具有很强的细胞或组织特异性的RNA分子。IncRNA测序可一次性获取样本中几乎全部的IncRNA信息，对IncRNA的类别、功能进行全方位的深入分析，从而快速全面准确的获得与特定生物学过程相关的IncRNA信息。
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Q：lncRNA测序的取样建议？
lncRNA测序细胞总量≥ 1 X 107个起送，全长转录组植物组织送样量须达到至少0.5g，动物取新鲜组织，组织体积要小，尽量长宽高≤0.5cm ，所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小，送样量须达到至少0.2g。血液样本通常建议送新鲜血样，哺乳动物全血：2.5-5ml；鱼类、禽类、两栖类全血：0.5-1.0ml 及以上。
Total RNA的送样要求：
Q：lncRNA 测序建库与常规转录组测序的区别是什么?
主要区别在于富集的方式不同。常规转录组用 oligo(dT)磁珠富集带有poly(A)尾的RNA，主要获得mRNA的表达信息。而lncRNA测序首先去除 rRNA，基于 rRNA去除后的总RNA（包含 mRNA 和 ncRNA）构建文库，可以同时获得 mRNA和 lncRNA（包括有poly(A)尾和无poly(A)尾）的表达信息。
Q：lncRNA 测序生物学重复是必须的吗?一般要重复几次?
生物学重复是生物实验所必须的，lncRNA测序也不例外，至少3次生物学重复。生物学重复的设置需要考虑研究成本、样本采集难度、数据分析能力、预期研究水平等多方因素。
Q：IncRNA 测序数据中是否同时有 IncRNA 和mRNA的表达信息?
lncRNA测序的建库方法是去除rRNA，保留总RNA。这些总RNA中既包含了所有的lncRNA，也包含了所有的mRNA。因此，在测序产生的数据中，既有来自lncRNA的reads，也有来自mRNA的reads。
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案例分享 长链非编码RNA在精索静脉曲张诱导的生精功能障碍中调节精子发生 ( Cell Proliferation，IF=8.755 )
本研究采用IncRNA-seq技术对精索静脉曲张（VC）大鼠中IncRNA进行了测序，结果验证了IncRNA在睾丸中的表达以及与精子质量的关系，揭示IncRNA在VC诱导的生精功能障碍中的表达和功能。
VC组DE IncRNAs共表达的鉴定
为了详细阐明VC大鼠睾丸精子质量受损的机制，作者收集了整个睾丸样本进行IncRNA测序。与假手术组相比，VC组有244个DE IncRNAs表达上调，27个DE IncRNAs表达下调。在VC组和手术治疗组的对比中，鉴定出82个DE IncRNAs，其中42个上调，40个下调。Venn图分析显示，两次比较有11个DEIncRNAs重叠。其中VC组有8个DE Incrna表达上调，3个DE IncRNAs表达下调。
IncRNA-miRNA-mRNAt&IncRNA可以作为miRNA海绵，通过ceRNA网络来调控miRNA靶向基因的表达。本研究鉴定出21种Mo-miR-301a-5p和Mo-miR-328a-5p，它们可能结合4种DE IncRNAs，基于4个IncRNA，2个miRNA，12个mRNA构建了IncRNA-miRNA-mRNA调控网络。
目的基因功能富集分析
基于已建立的ceRNA网络探索其生物学过程和途径。DE IncRNA与炎症或免疫相关的生物过程、凋亡和氧化应激密切相关，如免疫效应过程、细胞因子产生、先天免疫反应、防御反应调节、白细胞凋亡过程和氧化应激反应。类似地，也发现了几种KEGG通路，表明DE IncRNA与VC的行为相关。
PPI网络的构建与hub基因的鉴定
通过STRING数据库预测了一个PPI网络来显示hub基因的相互作用。Metascape功能富集分析表明，8个GO项，其中包括细胞因子介导的信号通路、神经元死亡、细胞因子产生的阳性控制、干扰素a产生和对外界刺激的反应，以及弓形虫病和先天免疫系统通路与枢纽基因显著相关。
结论
研究结果将有助于理解VC致生精功能障碍的这些机制，并为VC诱导生精功能障碍的诊断和治疗找到新的生物标志物。
参考文献
Wang S, et al. Long noncoding RNAs regulated spermatogenesis in varicocele-induced spermatogenic dysfunction. Cell Proliferation, 2022.
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LncRNA（长链非编码 RNA）是一类转录本长度超过 200nt，不编码蛋白质的RNA分子。目前lncRNA的研究不够完善，因此我们需要进行新lncRNA的预测。使用CNCI、CPC2以及 PLEK三个软件对新转录本进行编码潜能预测，取这些没有编码潜能的转录本交集作为可靠的预测结果。
统计各软件预测为 noncoding 的转录本条数绘制韦恩图，直观的展示各个方法预测出的 noncoding 转录本共有和特有的数目。
LncRNA 预测结果韦恩图
根据新lncRNA在基因组上相对于已知转录本的位置，我们将新LncRNAs 划分为以下几类：基因间区长链非编码lncRNA（Intergenic LncRNAs，简称lincRNA）、内含子长链非编码RNA（Intronic LncRNAs）、反义长链非编码RNA（Antisense LncRNAs）和正义长链非编码RNA（Sense overlapping LncRNAs）。新LncRNA类型统计图如下：
图 LncRNA 类型统计图
当一个lncRNA被剪切生成多个小RNA后，每一个成熟体会分别在不同的亚细胞结构行使各自的功能。成熟的miRNA可以作用多个位点，抑制翻译的过程和导致基因沉默；故鉴定miRNA及其靶基因有助于我们了解调控的过程。 我们将lncRNA比对到miRBase数据库寻找潜在的miRNA前体，使用RNAfold软件对比对上miRNA前体的LncRNA序列预测二级结构，结构图如下：
图 二级结构图
对lncRNA的差异靶基因进行富集分析，结果展示如下：
图 差异靶基因（顺式） GO 富集分析 dotplot 图
图 差异靶基因（反式） PATHWAY 富集分析barplot图
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