全长lncRNA测序

全长lncRNA测序是指无需对去除rRNA后的RNA进行打断，直接获取逆转录cDNA的5’到3’全长序列。不依赖于Poly（A）尾富集，同时对含有Poly（A）尾和不含有Poly（A）尾的IncRNA转录本进行鉴定和定量，并系统全面的进行可变剪切分析。

一、产品优势

1.无需拼接,直接获得全长lncRNA序列

2.对IncRNA转录本进行定量

3.鉴定lncRNA的可变剪切

4.捕获mRNA、tRNA、小RNA等其它类型的RNA

二、技术流程

三、应用方向

发育生物学

肿瘤学研究

免疫感染

环境毒理研究

Q：全长lncRNA测序的取样建议？

全长lncRNA测序细胞总量≥ 1 X 107个起送，全长转录组植物组织送样量须达到至少0.5g，动物取新鲜组织，组织体积要小，尽量长宽高≤0.5cm ，所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小，送样量须达到至少0.2g。血液样本通常建议送新鲜血样，哺乳动物全血：2.5-5ml；鱼类、禽类、两栖类全血：0.5-1.0ml 及以上。

Total RNA的送样要求：

Q：全长lncRNA测序能测到mRNA吗？

可以，全长lncRNA测序的结果中包含mRNA，以及不含polyA的lncRNA。

Q：全长lncRNA测序一般推荐测多少G数据？

全长转录组测序所需数据量与所研究物种的基因组大小有关，基因组越大，则所需数据量越大。一般来说：常规物种一般建议12G数据；基因组较大的物种，研究低丰度的转录本和可变剪接时，推荐测20G以上数据。

Q：全长lncRNA测序能测到miRNA吗？

测序结果中包含一部分miRNA，但是由于miRNA太短，测到的数量有限，如果是关注miRNA，推荐用二代的小RNA测序。如果即关注长的lncRNA，又关注短的RNA，推荐使用全长lncRNA测序。如果仅关注长的RNA，可用磁珠筛选长的RNA之后，再进行建库。

十字花科植物基因间区长链非编码RNA的鉴定与功能注释成果（The Plant Cell，IF=12.085）

 
综合分析了2018年12月之前NCBI上所有的拟南芥、亚麻荠、芜菁和盐芥的RNA-seq数据，超过16,000个RNA-seq数据。对拟南芥、亚麻荠、芜菁和盐芥（10天的幼苗、4周成熟的莲座状叶以及开放的花），进行Illumina lncRNA测序和ONT全长转录组测序。
 
分别从拟南芥、芜菁、亚麻荠和盐芥中鉴定出9306、58155、13163和20744个高置信lincRNA(HC-lincRNA)。
 

通过翻译组数据（Ribo-seq）和蛋白质质谱（MS）数据鉴定lincRNA中的微小阅读框（sORFs）和蛋白产物，共鉴定到1172个lincRNA 的TPM大于0.1，120个在Ribo-seq数据中检出，38个在MS数据中检出，并且编码的氨基酸数量在3到136个之间。此外发现，转录本与sORF长度无相关性，然而Araport11数据库的HC-lincRNA比Evolinc衍生的lincRNA含有更长的sORF。

 

 

参考文献
Kyle Palos, et al., Identification and functional annotation of long intergenic non-coding RNAs in Brassicaceae, The Plant Cell, 2022.

LncRNA（长链非编码 RNA）是一类转录本长度超过 200nt，不编码蛋白质的RNA分子。目前lncRNA的研究不够完善，因此我们需要进行新lncRNA的预测。使用CNCI、CPC2以及 PLEK三个软件对新转录本进行编码潜能预测，取这些没有编码潜能的转录本交集作为可靠的预测结果。

统计各软件预测为 noncoding 的转录本条数绘制韦恩图，直观的展示各个方法预测出的 noncoding 转录本共有和特有的数目。

LncRNA 预测结果韦恩图

根据新lncRNA在基因组上相对于已知转录本的位置，我们将新LncRNAs 划分为以下几类：基因间区长链非编码lncRNA（Intergenic LncRNAs，简称lincRNA）、内含子长链非编码RNA（Intronic LncRNAs）、反义长链非编码RNA（Antisense LncRNAs）和正义长链非编码RNA（Sense overlapping LncRNAs）。新LncRNA类型统计图如下：

新lncRNA类型统计

根据各比较组合的显著差异表达lncRNA，进行火山图分析。

差异表达lncRNA火山图

对lncRNA的差异靶基因进行富集分析，结果展示如下：

差异靶基因（顺式）GO 富集分析 dotplot 图

差异靶基因（反式）PATHWAY 富集分析 barplot 图

基因转录生成的前体 mRNA（pre-mRNA），有多种剪接方式，选择不同的外显子，产生不同的成熟 mRNA，从而翻译为不同的蛋白质，构成生物性状的多样性。这种转录后的 mRNA 加工过程称为可变剪接或选择性剪接（Alternative splicing）。通过 suppa2软件获取每个样品存在的可变剪接类型，对转录本发生可变剪接事件情况进行统计。

可变剪接类型分布图

可变剪切的差异分析就是对可变剪切产生的 isofrom 进行定量，然后进行差异分析。使用 suppa2（DiffSplice） 鉴定组间差异可变剪切，差异可变剪切数量统计如下表。

表 差异可变剪切类型统计表